1  材料与方法 

1．1  实验材料

1．1．1  植物材料

水稻日本晴野生型（Oryza sativa cv.Nipponbare L.），突变体材料，烟草（N.benthamiana）

1．1．2  菌株、载体

菌株：农杆菌EHA105；大肠杆菌DH5α、BL21均为本实验室保存菌株

载体：Venus，pGEX-4T和pET-28a

1．1．3  主要试剂、试剂盒

主要试剂、试剂盒：限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、DNA Ligase/KOD/DNA marker、质粒提取/PCR产物/琼脂胶回收试剂盒；烟草叶片侵染液MES、烟草叶片侵染液乙酰丁香酮、X-Gluc底物、PBS Buffer、还原型谷胱甘肽GSH、IPTG、SDS、PBST、Mutazyme、谷胱甘肽巯基转移酶（GST）；小麦(Triticum aestivum) E1（GI: 136632）、E2（AtUBC8）、AtUBQ14（At4g02890）、OsMYBc、OsMSRFP

1．2  研究方法

1．2．1  烟草瞬时表达方法

取光照/黑暗16/8小时，23-24℃培养4周左右的烟草，用1 ml一次性注射器吸取侵染液重悬的转有表达质粒的农杆菌液，从烟草叶片的背面注入到叶片中，适宜培养条件下表达48-60小时。

1．2．2  GUS活性测定

将植物组织加液氮研磨成粉末，加入GUS蛋白提取液后离心，收集上清冰上保存。之后取少量样品蛋白提取液，加入到反应液中，在反应进行中的第20 min和第40 min各取20 µl反应混合液加入到180µl Na2CO3溶液中停止反应；分别在激发波长365 nm，发射波长455 nm下测定荧光值。

1．2．3  质粒提取方法

将转有待提质粒的大肠杆菌单菌落接种于10 ml 含合适抗生素的LB液体培养基中，37℃，200转/分钟，摇菌14-16小时；之后将上述菌液转接到1L新鲜含合适抗生素的LB液体培养基中，37℃，200转/分钟，摇菌过夜；收集菌体后按照质粒提取试剂盒提取质粒。

1．2．4  GST标签蛋白原核表达及纯化

表达蛋白载体转入大肠杆菌BL21菌株中，阳性菌落转接至10 ml含Amp的LB液体培养基中，小摇过夜；之后以1:50的比例转接到200 ml含Amp的新鲜的LB液体培养基中，大摇。摇菌至OD600在0.8-1.0之间时，加入IPTG诱导表达。收集菌体后加入预冷PBS悬浮菌体，添加PMSF，超声破碎仪破碎细菌细胞以释放蛋白。将上清注入装载有1 ml glutathione-SepHarose 4B琼脂糖吸附柱中，4℃结合1小时。用预冷8倍体积的PBS冲洗吸附柱，收集洗脱成分，测蛋白浓度，做免疫印迹检验。

1．2．5  免疫印迹（Western Blot）检测

蛋白样品加SDS上样缓冲液，沸水中变性5-10 min后上样跑SDS-PAGE，活化PVDF膜以备转膜。转膜结束后，将PVDF膜浸泡在装有封闭液的培养皿中封闭30 min，期间放在脱色摇床上轻摆震荡。倒掉封闭液，加入GST一抗反应液，置于摇床上，反应3小时。回收一抗反应液，用PBST洗PVDF膜，3次×15min，再加入二抗反应液，置于摇床上，反应1.5小时。将PVDF膜浸入碱性磷酸酶底物显色液中显色，直至出现反应条带，用PBST洗掉显色液，膜晾干保存。

1．2．6  点突变实验

设计引物，进行PCR扩增。PCR产物体系中加入1 µl MutazymeTM37℃反应1小时消化甲基，之后转化PCR产物，做菌落PCR验证，测序确定正确质粒。

1．2．7  双分子荧光互补BiFC

将MYBc和MSRFP的CDS序列分别克隆入Venus的N端和C端，构建VN（R）-MYBc和MSRFP-VC。用VC和VN（R）做阴性对照。利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达，处理3天后收集烟草叶，使用Leica TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜检测荧光。