1 材料与方法

1.1 实验材料

选择籽取饱满的小麦种子, 用纱布包好, （75%乙醇灭菌30 s，无菌水冲洗3遍，10%次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗6遍之后取出置于垫有双层滤纸的大号培养皿中, 在30±1℃恒温下催芽。每个处理30粒种子，均匀铺于纸床上，4次重复。发芽1周后，开始酸化处理，对照组用正常Hongland培养液喷施，保持纸床湿润，处理组将Hongland培养液用HNO3调节pH到3.0喷施，处理1周后测量相关生理，并取样液氮速冻后，-70度冰箱保存用作蛋白提取。

1.1.1主要仪器设备

等电聚焦仪、电泳槽、 EttanTMDALT Six electrophoresis unit（24cm，Amersham Bioscience）、真空干燥仪、电泳仪、离心机 、真空离心浓缩仪、扫描仪、质谱仪。

1.1.2主要试剂

CHAPS、甲叉双丙烯酰胺、硫脲、琼脂糖、碘乙酰胺、尿素、碳酸氢铵、乙腈、丙烯酰胺acrylamide、DTT、SDS、IPG buffer pH3-10、Sequencing Grade Modified Trypsin。

1.2 实验方法：

1.2.1 胚根长度测定

    随机选取纸床发芽幼苗10颗，测定胚根长度，每个处理至少重复5次，取平均值。

1.2.2 叶绿素含量测定

参照苏正淑等[4]的方法。首先取鲜嫩小麦叶片0.25 g，蒸馏水冲洗干净。然后将小麦植株叶片磨成均匀液浆后放于20 ml的离心管内，随后加入10 ml乙醇和丙酮的混合液，暗处浸泡处理至少24 h；在浸泡处理过程中应该每隔6 小时振荡一次，直到叶片从绿色变成白色为止。再将叶绿素提取液倒入光径为1 cm的比色皿内，空白对照组为80%的丙酮，在波长分别为663 nm、645 nm、440 nm下测定吸光度A663、A645和A440。

叶绿素的含量(mg/g)＝（叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重

1.2.3蛋白质双向电泳：源'自:优尔:"论-文'网www.youerw.com

蛋白质的提取采用基于Tris-HCl饱和酚（pH7.5）-醋酸铵沉淀法。首先称取实验材料(0.4–1.0 g)用液氮速冻，速冻后研磨成粉末，并在冰浴条件下加入4 ml匀浆缓冲液研磨15 min呈现匀浆状态为止，再经过超声波破碎仪超声破碎1分钟（超声波破碎仪的功率为15%），随后进行抽提，抽提时采用等体积的Tris-HCl pH7.5饱和酚，低温匀浆30 min后在15000 rpm，4℃条件下离心20min，并将酚相收集起来，将甲醇配制的0.1M的醋酸铵以3倍体积加入到其中且在-20℃条件下沉淀过夜。同样在15000 rpm，4℃条件下离心获取蛋白沉淀，将沉淀用冷丙酮（含13 mM DTT）清洗3次，随后将沉淀冻干。

  蛋白质双向电泳

制备好蛋白质样品以后，就要通过双向电泳技术来分离检测蛋白质。实验过程中采用的IEF/SDS双向聚丙烯酰胺凝胶电泳方法是对Brush M等[5]的方法的改进。具体操作如下：

  第一向等电聚焦

（1）样品缓冲液的配制

从冰箱中取在-20℃条件下冷冻保存的不含DTT且不含IPG样品缓冲液（I）一小管（1ml/管），随后将0.01gDTT加入到小管内，充分地混匀溶解。