毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是1970年之后才逐渐发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统，与原核表达系统相比，毕赤酵母表达系统有着比如可操作性简单、更加容易培养、生长速率高、表达量好、低廉的成本等诸多优势[10]。P. pastoris能够利用甲醇，是因为甲醇能够诱导其表达甲醇代谢所需要的醇氧化酶 (Alcohol Oxidase, AOX) 的基因表达，产生AOX1和AOX2，可以使其含量高达总细胞蛋白的35%~40%，与以葡萄糖、甘油或者乙醇作为碳源相比，表达量能够达到后者的上千倍。在以葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源时，AOX几乎得不到任何表达[11]。

毕赤酵母表达系统也不是尽善尽美的，比如有些蛋白在利用毕赤酵母系统分泌表达时会有糖基化问题的出现，造成最终获得纯化的目的产物时带给我们很多不必要的麻烦，现在我们利用基因工程中点突变的方法引入N-糖基化位点的方法来判断突变前后糖基化对弹性蛋白酶稳定性的影响。

毕赤酵母N-糖基化问题通常的几种改造方法：通过调整培养基成分以达到降低目的产物糖基化的目的；在尽量不影响蛋白活性和功能的前提下，可以利用定点突变的方法来改变蛋白糖基化位点以达到阻止糖基化的目的，如将糖基化位点Asn-Xaa-Ser/Thr结构的Asn定点突变为Ala，可以完全阻止糖基化；通过诱变处理选育目的产物糖基化程度较低的菌株；利用基因工程方法改造N-糖基化可以达到同样的目的[12]。　

因为利用定点突变技术在氨基酸序列中引入N-糖基化修饰位点是蛋白引入N-糖基化修饰的一种具有良好可操作性的蛋白改造方式。本实验尝试性地在重组弹性蛋白酶氨基酸序列中的三个不同位点引入N-糖基化位点，N-糖基化修饰的差异可能会影响到酶的稳定性。因此本实验研究了引入N-糖基化修饰对重组弹性蛋白酶在稳定性的影响。

引入的N-糖基化位点突变：酶蛋白的氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr是潜在的N-糖基化位点，为了在重组弹性蛋白酶引入N-糖基化位点，需要选择性突变相应的氨基酸残基，使酶蛋白氨基酸序列中出现新的Asn-Xaa-Ser/Thr。在选择突变位点时，突变氨基酸的位置要避开或是远离弹性蛋白酶中具有一定功能的氨基酸残基，也就是要避开或远离活性部位关键氨基酸残基、参与锌离子和钙离子结合的氨基酸残基以及二硫键形成的氨基酸残基；另外在空间结构上也不能靠近要这些功能部位，以免引入氨基酸残基的突变和N-糖基化修饰干扰其正常的功能[13]。