1.1材料

1.1.1供试菌株

细极链格孢（Alternaria tenuissima）由重点实验室109提供。

1.1.2试验试剂

（1）粗提取试剂：

NaOH（分析纯），HCL溶液（分析纯），无水乙醇（分析纯），(NH4)2SO4（分析纯）

（2）萃取试剂：

乙酸乙酯试剂（分析纯），四氯化碳试剂（分析纯），氯仿试剂（分析纯），苯试剂（分析纯），正丁醇试剂（分析纯）

（3）Doskochilova八溶剂系统层析试剂：

水饱和正丁醇，水饱和正丁醇包含2%对甲基苯磺酸，丁醇：醋酸：水=2:1:1，水饱和正丁醇包含2%六氢吡啶，正丁醇饱和的0.5mol/L的pH=7.0的磷酸缓冲液，正丁醇饱和的水包含2%对甲基苯磺酸，苯：甲醇=4:1，（滤纸用0.5mol/L pH=7.0磷酸缓冲液处理），文献综述

75%甲醇：25%水（滤纸用5%的硫酸钠处理）

（4）纸电泳试剂：

0.4mol/L的Na2HPO4，0.2mol/L的Na2HPO4，0.2mol/L的NaAc，0.2mol/L的HAc

1.1.3仪器设备

HH-2型数显恒温水浴锅，微量台式离心机，pH计，DHP-420电热恒温培养箱，DYY-6C型电泳仪，GZX-GFC-101-2-BS电热恒温鼓风干燥箱，85-2型恒温磁力搅拌器，HH-2型数显恒温水浴锅，全光照培养箱，500ml分液漏斗，500ml容量瓶，200x200mm,200x100mm层析缸，0.5x100mm玻璃点样毛细管，中速滤纸

1.2试验方法

1.2.1发酵液培养

用小刀将马铃薯皮削掉,称取200g马铃薯放入锅中，切成1cm3的小块，向锅中添适量的水，先是大火煮沸，再改小火煮30min，煮的过程中若是水蒸发变少可适当地补充一些水 ，用纱布过滤，滤液加葡萄糖20g，补足水至1000ml，然后置于旋转搅拌器上搅拌5到10min，准备50ml的锥形瓶若干，倒入液体培养基，注意不能超过20ml，塞上瓶塞，最后置于121°C灭菌锅中灭菌，冷却后取出。

    在无菌操作台中将事先培养好并冷藏在冰箱内的冬青菌种接种到原先制作好的马铃薯培养液中，将其放在恒温箱中培养，等待20d后，取出备用。

1.2.2菌丝预处理

    准备一个大锥形瓶和一张尺寸合适的滤纸，进行过滤，然后收集菌丝体30g，发酵液备用。菌丝体上的发酵液可能会存在抗肿瘤活性成分，所以为了避免其影响，冬青菌丝体需要用无菌水冲洗三次以上，从而去除发酵液[3]。

    将菌丝体平均分成两份，每份15g，其中一份用15ml蒸馏水浸泡2d；另外一份先放在50℃烘箱内，除去菌丝表面的水分，烘干后取出再加入15ml无水乙醇浸泡两天。然后通过过滤去除菌丝体，得到浸提液。将浸提液放入烘箱进行浓缩结晶，再加入1ml PBS，使之充分溶解。然后进行生物活性测定。

1.2.3发酵液预处理

（1）加热法处理发酵液

    准备5支小试管，用移液枪分别移取5份1ml冬青发酵原液于试管中。放于不同温度梯度（60℃开始，以10℃温度梯度上升，直到100℃）恒温水浴锅中浸泡30min即可，看有无沉淀产生。

    如果发现沉淀，为了分离上清液，则用超速冷冻离心机进行离心，设置12000rmp，离心30min，沉淀合并。分别取1ml上清和1ml沉淀,进行生物活性测定。

（2）调节pH法处理发酵液

    先取1份20ml发酵原液置于小烧杯里，用pH计测量其原液pH，然后用0.5mol/L的稀盐酸向下调节pH，再取1份20ml发酵原液置于小烧杯里，用0.5mol/L的氢氧化钠向上调节pH，所需pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，每到一个所需值就取1ml于小试管中，得到10个不同pH下的发酵液，观察发酵液的pH变化时，是否有沉淀产生。若有沉淀产生，放入冷冻离心机中，并配对好，设置12000rmp，离心30min，将上清取出，沉淀合并，分别取1ml上清和1ml沉淀，进行生物活性测定，。来,自|优;尔`论^文/网www.youerw.com 细极链格孢抗肿瘤活性物质的初步分离(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_80712.html