（南京建成生物工程研究所），石蜡切片机，光学显微镜（徕卡,德国），PCR 仪，流式细胞仪（BD biosciences），GraphPad Prism5 分析软件。

2。3 动物

6 周龄雄性野生型 C57BL/6 小鼠 24 只，从扬州大学比较医学中心购买。小 鼠施以 12h 的光照周期：光照/黑暗（7: 00 ，19: 00），以保持小鼠正常的节律。 小鼠自由摄食和饮水，体重 20-25g。

2。4 实验流程文献综述

将购买 6 周龄雄性野生型 C57BL/6 小鼠，随机分为四组：对照组（Ctrl）、 索拉胶组（salecan）、模型组（ConA）、模型+索拉胶组（ConA+salecan），每 组 6 只。salecan 组和 ConA+salecan 组小鼠连续三天腹腔注射索拉胶 30mg/kg， Ctrl 组、ConA 组注射同等体积 PBS。第三次索拉胶注射 1h 后给予 ConA 组、 ConA+salecan 组小鼠尾静脉注射 20mg/kg ConA 诱导自身免疫性肝炎发生，Ctrl 组和 salecan 组小鼠尾静脉注射同等体积 PBS。模型建立 8h 后处死小鼠，取血清、 肝脏组织等进行各项指标的检测。

2。5 血清 ALT、AST 检测

血清 ALT、AST 是肝功能检测里的主要指标，对于人类，谷草转氨酶（AST） 含量正常值是 8-40u/L，各种肝病、肝细胞坏死、肝硬化肝癌都会导致其异常偏 高；谷丙转氨酶（ALT）含量的正常值是 5-40u/L，肝药物性中毒、肝变性、肝

本科毕业设计说明书 第 7   页 硬化都会导致其异常偏高。摘掉小鼠眼球，在小鼠眼球框取血获得小鼠的外周血， 静置于室温凝固 0。5h 后，3000rpm 离心 10 分钟，吸取上层血清。测量 ALT 和 AST 使用丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的微型试剂盒，按照试剂 盒的说明检测血清中 ALT、AST 的水平，通过比色法测定，对比 ALT 与 AST 标 准曲线得出其含量。

2。6 肝脏组织 HE 染色

(1)  各组小鼠取相同位置的一叶肝脏，浸泡于 4%中性福尔马林中过夜；

(2) 进行梯度脱水：75％乙醇 30min，80％乙醇 30min，85％乙醇 30min，90％乙 醇 30min，95％乙醇 20min，无水乙醇 5min/8min（两次），用 1：1 的乙醇/ 二甲苯浸泡 15min，用二甲苯浸泡 5min 使组织透明，用 1：1 的二甲苯和石 蜡浸泡 5min，用石蜡浸泡 5min/8min（两次），包埋组织；

(3) 在石蜡切片机上以 5μm 的厚度切片，展片机中充分展片片刻，拷片机上 37°C

拷片 3 小时；

(4) 二甲苯 12min，100%、95%、90%、80%、70%、50%、30%乙醇分别复水处 理 3min，水 3min，苏木精染色 2min，自来水中冲 5min，水 3min，30%、 50%、70%、80%、90%、95%乙醇分别脱水处理 3min，伊红染色 2min，95% 乙醇 3min，无水乙醇 3min，二甲苯 10min，中性树胶封片，晾干，镜下观 察。

2。7 定量 PCR 检测肝脏中转录因子水平

(1) RNA 抽取：取肝脏约 50mg 加入 500μl TRIzol 中，匀浆，加 100μl 氯仿摇匀， 静置 10min，4°C 下 11000g 离心 15 分钟。取上清约 250μl，加入等体积的异 丙醇充分混匀，静置 10min，此时出现的白色固体即为 RNA。随后 4°C 下 11000g 离心 10 分钟，弃上清，沉淀用 1ml 75%乙醇（DEPC 水配置）洗涤，

4°C 下 7000g 离心 5 分钟，弃上清，沉淀用无菌风吹干，最后加入 DEPC 水 溶解，-80°C 保存。

(2) 逆转录：取 13μl DEPC 水溶解的 RNA，依次加入 1μl Oligo dT18（10μM）， 1μl dNTP（10μM），65°C 保温 5min，之后立即转入冰浴，保温 5min。加入 5×Reaction Buffer 4μl，1μl，，37°C 水浴保温 1h，最后放入 70℃金属浴保温 15min，制得 cDNA 样，-80°C 保存。来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com 索拉胶对刀豆蛋白A致小鼠肝损伤保护作用研究(6):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_83613.html