转基因育种技术，在给人类带来丰厚经济利益的同时，也存在严重的安全隐患。转基因食品潜在的问题包括：转基因食物的致敏性、转基因食品的毒素蛋白发生过量表达导致毒性、改变人体内营养元素等[7]。其对于生态环境和人类健康都有着潜在的威胁。因此，世界各国在大力研发GMF的同时也在积极研究GMF的安全检测分析方法。

 目前，转基因检测技术主要分为两大类，一类是基于蛋白质检测的蛋白检测技术，另一类是基于核酸检测的DNA检测技术[8]。DNA检测技术较蛋白检测技术更为稳定，使用范围更广、准确性更高，DNA检测的方法主要有PCR法、核酸印迹法(Southern Blot)、基因芯片、毛细血管凝胶电泳法、高效液相色谱法、实时荧光PCR法等[9]。其中PCR法即聚合酶链式反应，检测灵敏度高，操作简单，既能定性又能定量检测，是筛选鉴定外源基因整合情况的最常用和有效的技术[10]。聚合酶链式反应是一种特异性扩增DNA片段的分子生物学技术，实际上是利用模板DNA、聚合酶、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在条件下的酶促合成反应，能够快速扩增出特定基因片段的技术[11]，可以对待测样品中基因的整合情况进行筛选、鉴定和分析。本研究主要以冬小麦为实验材料，根据国家发布的检测标准，采取定性PCR技术，对待测样品冬小麦的外源基因进行检测分析。

2 材料与方法

2。1 材料

阳性质粒DNA (含有Ubiquitin、NOS、bar、uidA基因）和待测样品有中国农业科学院国家检测中心提供，阴性对照由淮阴师范学院刘乃森老师提供。

2。2 试剂与耗材文献综述

   提取DNA需要的CTAB和SDS抽提液均由本人通过查阅相关资料自己配制，定性PCR使用的Taq聚合酶、dNTP、MgCl2、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2。3 仪器设备 

离心机、恒温水浴箱、纯水系统、核酸测定仪、微量移液器、天平、普通PCR扩增仪、电泳槽和电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统等。

2。4 方法

2。4。1 DNA的提取与纯化

本实验分别采用改进的CTAB法和改进的SDS法抽提基因组DNA，对比分析，选择更适合PCR扩增条件的DNA溶液。两种提取方法的具体步骤分别如下：

A、改进的CTAB法抽提小麦颗粒中的基因组总DNA

（1）将冬小麦颗粒使用MJ-BL25B2型美的搅拌机粉碎成粉末状，称取0。 2 g粉末置于2mL离心管中，加入600μl 已经预热到65℃的2×CTAB，混合均匀，使其充分裂解。

（2）将离心管放入恒温水浴箱中，65℃温育40分钟，期间颠倒混匀数次。plsql的oracle解析json字符串函数

（3）加入等体积（600μl）的氯仿:异戊醇（24:1）。

（4）颠倒混匀约30分钟，室温下，4000rpm离心20分钟。

（5）取上清（约500μl）于新的1。5ml离心管中，加入等体积（500μl）的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。

（6）颠倒混匀5分钟，室温，4000rpm离心20分钟。

（7）取上清（约400μl）于1。5ml新的离心管中，加入200μl1M的NaCl溶液。

（8）加入2/3体积（400μl）已预冷的异丙醇，混匀，﹣20℃放置至少30分钟。

（9）4000rpm离心10分钟，弃上清，在吸水纸上放置1min，吸干水。

（10）加入500μl75％的乙醇清涤，4000rpm离心10分钟，弃上清。

（11）重复步骤10，弃上清后置于超净台吹干。

（12）用100μl纯水溶解DNA，-20℃保存备用。

B、改进的SDS法抽提基因组总DNA：

（1）将冬小麦颗粒使用美的搅拌机（MJ-BL25B2）粉碎成粉末状，称取0。 2 g粉末置于2mL离心管中，立即加入600μl预热（65℃）DNA抽提液，摇匀，随后加入100μl预热（65℃）的20％SDS，65℃水浴锅中放置10min，期间反复混匀几次。 冬小麦外源基因定性检测分析(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_84488.html