河蚬俗称蚬、黄蚬， 隶属于瓣鳃纲(Lamellibranchia)， 蚬科(Corbiculidae)， 蚬属 (Corbicula)，其分布广泛, 不仅广泛分布于我国的江河湖泊等淡水区域，在苏联,朝鲜,日本 和东南亚各国均有记载，河蚬是一种经济的淡水贝类,营养丰富,据分析观肉蛋白质含量为 5。3%，蚬肉甘润清凉,可治盯病、糖尿病等。不但味道鲜美且营养价值高,还含有某些特殊的 活性成分。但随着过度捕捞以及环境恶化的影响，河蚬养殖业开始受到制约，故而，河蚬的 人工繁殖及育苗培养开始新盛。

然而，相对于河蚬的营养及养殖价值，对河蚬的科学研究较为匮乏。目前，关于河蚬的 研究报道主要集中于河蚬的繁殖生物学、生物学特性[3]、性腺发育及资源评估等。而关于河蚬 遗传学方面的研究则更加有限，其中丁怀宇等利用 10 个中高度多态性的微卫星标记分析了洪 泽湖河蚬 4 个野生群体的遗传结构，并认为洪泽湖河蚬群体间并未出现明显的遗传分化，可 将洪泽湖河蚬作一个单元进行种质资源保护和管理。另外，国外也有关于河蚬微卫星的相关 报道，如 Peñarrubia et al 在河蚬基因组中开发了 246 个微卫星标记，但是只有 9 个表现出 多态性，多态性非常低。目前关于河蚬 EST 微卫星的研究尚未见报道，因此本研究拟从河蚬 的转录组测序序列中开发河蚬多态性微卫星标记，从而为后续的河蚬遗传结构分析，种质检 测及遗传图谱构建积累有效标记。

2 材料与方法

2。1 材料

本研究所用河蚬均取自江苏省淮安市洪泽湖，随机取 30 只，样品运回实验室后，取河蚬 斧足肌肉组织，置于灭菌的 1。5ml 离心管中，向离心管中加入无水乙醇，对离心管进行编号， 将处理完成的样品置于 4 摄氏度冰箱中储存备用。

2。2 微卫星位点查找及引物设计

本研究从河蚬转录组测序 EST 序列中利用 SSRHunter 软件查找含有三碱基至六碱基重复 的微卫星序列，重复次数设置为不少于 7 次，然后利用 Primer5 软件对获得的微卫星序列进 行引物设计。微卫星引物设计遵循以下原则：

1。引物长度为 17-25bp；2。GC 含量要求大于 40%；

3。退火温度大于 46；

4。预期的产物长度为 100-300[7]

2。3 河蚬基因组 DNA 的提取

1) 用洁净的镊子取固定于无水乙醇的河蚬肌肉组织 100-200mg（约指甲盖大小）放入 2mg 灭菌离心管中，用洁净手术剪刀将其剪碎，剪碎后晾干使酒精挥发，注意每剪完一个样品， 剪下一个之前将镊子和剪刀在蒸馏水中漂洗，然后用酒精棉擦拭以防样品污染。

2) 用移液枪向离心管中加入 500-800uL 抽提缓冲液及 2。5 uL(1mg/mL)蛋白酶 K（根据样品量 确定加入抽提液体积），置于 55℃烘箱或水浴锅中消化反应 4-5 小时或消化反应过夜（开 始进行消化反应的半小时每隔 5 分钟翻转样品管，使成团组织块分散），消化至样品管内 看不到组织碎块完全成为液体。

3) 从水浴锅或烘箱中取出消化好的样品，室温下放置冷却至室温。

4) 向离心管中加入等体积的平衡酚（抽提缓冲液：平衡酚=1：1，平衡酚 PH=8。0）。

5) 手工(或样品混匀仪)上下翻转样品 15-20min，混匀管内容物使之成为乳浊液。第一次向样 品管内加入平衡酚时，翻转样品管 1 小时以上蛋白抽提效果较好，更容易转移上清液。

6) 将混匀后的离心管置于离心机中，4℃下，10000rpm 离心 10min,使有机相与水相充分分离。 用剪口的钝枪头轻轻吸取水相（上清液），转移至新的无菌离心管中，弃去两相界面的蛋 河蚬多态性EST微卫星标记的筛选(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_86594.html