β-葡萄糖苷酶在果酒和茶叶中起到增加香味的作用，在各种不同因素下，各茶叶中的β-葡萄糖苷酶活性也有所不同[17]；在植物中，它具有防御害虫的作用；在医学方面，在某些癌症的诊断、治疗中发挥着作用[18]，并有所成就；在降解纤维素方面，虽然里氏木霉纤维素酶可分解它产生葡萄糖，使得世界部分资源得以再生，但是额外添加β-葡萄糖苷酶可以提高纤维素酶的作用效果[19]。

1。4。2 β-葡萄糖苷酶的基因工程研究进展

自发现β-葡萄糖苷酶起，大家对它的研究已经有很多年的历史了。在基因克隆方面，微生物中以真菌居多，植物也有所研究。Candelas L，Ramon D[20]于1990年从芽孢杆菌分离出的两个编码β-葡萄糖苷酶基因bglA和bglB的核苷酸序列，其编码的蛋白质分别是胞内酶和胞外酶[21]。山东大学邹文[22]等以黄单胞菌XA5-5为供体菌,广泛寄主质粒pRK404为载体,在大肠杆菌中克隆了一个β-葡萄糖苷酶基因，重组质粒pLZS1接合导入黄单胞菌XA5-5，得到了克隆子XA5-5（pLZS1)[23]。在国外，已有人通过PCR方式扩增出耐热子囊菌的β-葡萄糖苷酶BGL I基因，并且成功表达；在国内，对已知β-葡萄糖苷酶基因的异源表达的研究已经有所进展。

总之β-葡萄糖苷酶既具有水解作用，在各行各业也起到不同的作用。目前对它的研究已经越来越多，在日后将会发现更多地关于β-葡萄糖苷酶的研究成果。

2  材料与方法

2。1  实验材料 

2。1。1  菌株与质粒

本实验选用大肠杆菌（Escherichia coli DH5a）作为克隆宿主，质粒DNA保存在其体内，选用里氏木霉QM9414，选用一个含有T-DNA的二元载体pCAMBIA-1300，Kanr，Hygr，均由淮阴师范学院生命科学院研究室保存。

 2。1。2  主要试剂及培养基

主要试剂：PCR引物由赛百盛基因技术有限公司合成，各种DNA Marker、XbaI、HindⅢ、T4 DNA Ligase、Taq DNA Polymerase、Fastpfu酶、RNase酶、Fastpfu酶均购于宝生物工程(大连)有限公司（TaKaRa），dNTPs购于北京佳兰生物科技有限公司，exDNA导纳凝胶回收试剂盒购于淮安百慧公司，分子生物学试剂购于TaKaRa，北京索莱宝科技有限公司等。培养基：PDA培养基、LB 培养基。

2。1。3  琼脂糖凝胶的制备

首先在三角锥瓶中加入60ml制胶缓冲液+1。2g琼脂糖粉，制成2%琼脂糖。接着在微波炉中加热溶解琼脂糖，（用微波炉加热琼脂糖时，要防止过热引起琼脂糖沸腾溢出）使溶液冷却到60℃左右。然后将琼脂糖溶液倒入灌胶盒中，选择合适位置插上梳子。最后室温下使胶凝固（大约30min），然后放置到电泳槽中，倒上电泳缓冲液（没过凝胶1mm为好），拔出梳子。

2。2方法

从里氏木霉QM9414中提取β-葡萄糖苷酶cel3c，以里氏木霉基因组DNA为模板，用特异性引物，将β-葡萄糖苷酶cel3c和启动子分别进行克隆，然后通过重叠PCR的作用将β-葡萄糖苷酶cel3c的基因序列连接在看家基因（β-actin）的启动子后面，因为两者具有重叠序列，通过酶的作用可将其第一个密码子连接在β-actin的启动子后第一个的密码子位置上。并将其克隆到二元载体pCAMBIA-1300 中，这样各β-葡萄糖苷酶的表达将受β-actin的启动子的控制。最后经过测序鉴定后导入受体细胞中，进行低温保存。简要步骤如图1所示

2。2。1  目的基因cel3c和启动子Pact的扩增

1。 cel3c的扩增

（1）引物设计

  根据cel3c克隆的DNA片段序列，设计引物为cel3c-Act-F和cel3c-R，cel3c-Act-F的序列为TCAGTCACAATGGCTGATATTGATGTTGAGGCC，其中双下划线标记序列是是Pact的基因序列，下划线标记基因是cel3c的基因序列。Cel3c-R的基因序列为ATTTAATTAAGCTTATATGACATCTTCGCAGGAACAAGC，其中粗虚下划线标记基因是HindⅢ限制性内切酶的识别位点，引物cel3c-Act-F和cel3c-R均为赛百盛基因技术有限公司合成。 里氏木霉中β-葡萄糖苷酶cel3c的克隆(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_88094.html