TSB：LB PH6。1，10% PEG3350，5% DMSO，10% 甘油，10mM MgCl2，10mM MgSO4，高压灭菌。

5*KCN：0。5 M KCl，0。15 M CaCl2，0。25 M MgCl2。配几mL，过滤除菌，-20℃保存，可反复冻融。

溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8。0)，10mM EDTA(pH 8。0）。1M Tris-HCl (pH8。0）12。5mL，0。5M EDTA（pH 8。0）10mL，葡萄糖4。730g，加ddH2O至500mL。高压灭菌15min，贮存于4℃。

溶液Ⅱ：0。2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1mL，10%SDS 1mL，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。

溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4。8。5M KAc 300mL，冰醋酸 57。5mL，加ddH2O至500mL。4℃保存备用。

核酸电泳缓冲液（50*TAE，1000mL）：Tris碱242g ，冰乙酸57。1mL，0。5mol/L EDTA（pH 8。0）100mL。

工作液浓度为1*TAE

2。3  实验仪器设备

本实验所用到的仪器设备如下：PCR仪、电泳仪、生物电泳图像分析系统仪器、台式离心机、电热恒温水槽、微量移液器枪、冰箱、微波炉、恒温振荡器、全温振荡培养箱、隔水式恒温培养箱

3  实验过程与方法

3。1  大肠杆菌DH5α感受态细胞制备及转化

    菌株活化：从-70℃冰箱中取出冻存的大肠杆菌DH5α菌株，划线LB平板，37℃过夜

培养。挑取活化的BL21单菌落入装有3mL 液体LB培养基的试管中，37℃200转，振荡培养过夜。从试管中转接1mL菌液入装有100mL液体LB培养基的三角瓶中，37℃200转，振荡培养，适时监测菌体浓度，至OD600在0。3-0。5之间时，置于冰水中停止菌体生长，并用4℃，6000转，5分钟，离心回收菌体细胞。用冰水预冷的TSB溶液10mL重悬菌体。冰上放置10分钟，分装180μL每个PCR管(在冰上操作），置于-70℃冰箱中保存备用[7]。

酶连产物10μL，无菌双蒸水30μL，5*KCN溶液:10μL，加入灭菌的1。5ml离心管中，置冰水中备用。-70℃冰箱中取出感受态细胞，立即融化，取50ul置上述体系中，轻轻吹吸混匀。冰水浴20min。室温10min。加入500μLLB，150转37℃振荡培养40-50min复苏。6000转离心浓缩，涂布相应抗生素平板，37℃过夜培养，筛选转化子。

3。2  质粒提取

划线相应抗生素平板，活化含有相应质粒的菌株。挑取各菌株的单菌落到相应的抗生素LB液体培养基中37℃，200转，过夜振荡培养。取1。5mL菌液到离心管中，12000g，1min，离心弃上清，回收菌体。加入100μL冰预冷的溶液Ⅰ，剧烈震荡，重悬菌体。加200μL新配制的溶液Ⅱ，颠倒混匀，放置3min。加150μL用冰预冷的溶液Ⅲ，颠倒混匀，冰上放置5min。（-20℃冰箱）（基因组沉淀下来，质粒DNA仍处溶解状态）12000g离心5min，将上层溶液转移到另一离心管。加两倍体积的无水乙醇（质粒DNA此时溶解度低），颠倒混匀。-20℃放置30min，沉淀质粒。12000g离心5min，弃上层清液。离心管倒置于纸巾上，使所有液体流出，1mL70%乙醇洗涤并风干沉淀。用适当体积TER溶解核酸，琼脂糖凝胶电泳检测后于-20℃保存备用[8]。