灵芝作为中国传统的大型药用真菌，含有多种有效的药用成分。灵芝具有极佳的药用价值和投资价值，因而人们对灵芝的研究越来越多。目前，随着灵芝基因组测序工作的完成，以及灵芝研究分子遗传学手段的不断进步，使得人们对灵芝的研究逐渐从培养条件的优化转变到遗传分子领域的探究。本实验室前期建立起一套成熟的RNA干扰体系，具有沉默效率高、稳定性好、对其他基因表达影响小的特点。运用基因干扰技术，实现了对HO基因的沉默，并分析了它的功能，并利用突变菌株与野生型菌株的差异，考察HO基因是否参与灵芝的生长发育调节，灵芝细胞的信号传递，灵芝三萜生物合成，细胞壁合成等代谢活动。这些研究有助于我们了解外源信号调控与生长发育之间的关系，了解灵芝抵抗外界胁迫的调控机理和生物学意义。这为推动灵芝作为一种大型担子真菌成为研究真菌生长发育、此生代谢、信号传递的模式真菌提供理论依据。本文通过克隆灵芝的HO基因，构建该基因的沉默突变菌株，并对其进行生物学特性分析，研究其功能。

1  材料与方法 

1．1  菌株和质粒

灵芝（Ganoderma lucidum HG）菌株G20来自上海农科院，大肠杆菌DH5ɑ储存在本实验室。pMD19-simple T vector、pAN7-dual vector等相关构建载体来自大连Takara公司。溶壁酶来自于广东省微生物研究所。所用抗生素等来自与上海生物工程公司。

1．2  菌株的培养

1。2。1  培养基配制配方   

    CYM培养基：1%麦芽糖，2%葡萄糖，0。2% Yeast Extract（酵母提取物），0。2% peptone（蛋白胨），0。05% MgSO4·7H2O，0。46% K2HPO4。若配制固体培养基，则再加入2% Agar（琼脂）。

PDA马铃薯培养基（1L）：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g（固体）。

LB细菌培养基（1L）：Tryptone（胰蛋白胨）10g，NaCl 10g，ddH2O定容只1L，pH 7。0。若配制固体培养基，则再加入20g Agar（琼脂）。

1。2。2  种子培养   

    固体斜面种转接至PDA固体培养基上，培养在28℃，5d。

液体发酵：二级种子打碎均匀后，将所获得的菌丝体悬液接种至含有100mLCYM培养基的250mL三角瓶中，150rmp，在28℃震荡暗培养7d。

1。3  常用溶液

碱裂解法质粒提取试剂：

溶液I：50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl（pH8。0），10mmol EDTA（pH8。0）

溶液II：0。2mol/L NaOH，1%（w/v）SDS，现配现用

溶液III：5mol/L 乙酸甲60mL，冰乙酸11。5mL和28。5mL重蒸水混合。

TE缓冲液：10mM Tris·Cl(pH8。0),1 mM EDTA，根据需要调节pH至7。6或8。0。

TBE电泳缓冲液：配制5×贮存液：54g Tris碱，27。5g硼酸，20mL 0。5M EDTA（pH8。0），定容至1L。电泳时，稀释成0。5×工作液。

10mg·mL-1RNase：称取100mg RNase溶于10mL 10mM Tris·Cl(pH7。5),15mM NaCl中，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装后于-20℃保存。

磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：137mM/L NaCl，2。7mM/L KCl，10mM/L Na2HPO4，2mM/L KH2PO4，用800mL蒸馏水溶解8g NaCl，0。2g KCl，1。44g Na2HPO4，和0。24g KH2PO4。 用HCl调节pH至7。4后加水至1L。

1。4  主要仪器

ABI2720型PCR仪，冰箱，超净工作台，水浴锅，DYY-10C型电泳仪，DYCZ-20B型电泳槽，Eppendorf Centrifuge 5417R型台式低温告诉离心机，Nikon EclipseTi-S光学显微镜，Leica TCS SP2激光共聚焦显微镜，Eppendorf realplex2荧光定量PCR仪，Agilent 1290 infinity UPLC，BTX电转仪，凝胶电泳成像仪，7231型分光光度计。

1。5  实验方法 灵芝中血红素加氧酶的基因克隆及其功能的初步研究(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_96684.html