1。5。1  碱裂解法提取质粒[14]

挑取含沉默载体的大肠杆菌DH5ɑ单菌落，接种与LB+Amp抗性液体培养基中，37℃摇床培养12h。

吸取1mL菌液，12000rmp×1min RT，收集沉淀的菌体，加入溶液I 100µL，使菌体悬浮起来。

现配溶液II，吸取200µL加入，轻轻摇晃混匀。

吸取加入溶液III150µL，混匀后在-20℃中放置10min。

12000rmp×10minRT。

把上清转移到新管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），摇晃混匀后离心12000rmp×5min；转移下层，再加入1/10体积NaAc和2倍体积无水乙醇，在-20℃中沉淀10min；

12000rmp离心10min。

去上清，用75%乙醇洗涤干净，自然晾干。

    在ddH2O中溶解，放置于-20℃保存备用。

1。5。2  HO基因沉默片段的PCR扩增[15]

使用软件Primer 5设计HO基因沉默引物PET-32ɑ，并已灵芝cDNA为模板扩增HO基因沉默片段，得到沉默片段。

PCR扩增体系：

5×PS Buffer                       5µL

dNTPs（total 10 mM）               2µL       

AP1-inter-F/R（20 mM）           各1µL

灵芝模板cDNA                       1µL

ddH2O                           14。8µL

Primer Star DNA 聚合酶（5 U/µL） 0。2µL

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总体系                            25µL

扩增程序：

94℃ 5min

94℃ 30s

55℃ 30s       30cycles

72℃ 45s

72℃ 10min

扩增产物取3µL进行1%的琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。

1。5。3  HO基因沉默片段、沉默载体的双酶切与回收

将2倍体积无水乙醇加入到PCR扩增产物中，在-20℃中沉淀过夜，12000rmp离心10min，用75%乙醇洗涤干燥，沉淀在ddH2O中溶解。进行双酶切。

Nco I和EcoR I的双酶切体系：

ddH2O                          10µL

10×M Buffer                    2µL

质粒DNA（或目的片段）           7µL

Nco I                         0。5µL

EcoR I                        0。5µL

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总体积                         20µL

37℃温浴3h。1。5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切条带。

1。5。4  片段与载体的连接

建立连接反应体系：

目的片段                 （0。2µL）XµL

T-载体                  （0。01µL）1µL

10×T4 Ligase Buffer              2µL

T4 Ligase             （350 U/µL）1µL

ddH2O                      （16-X）µL

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总体积                           20µL 灵芝中血红素加氧酶的基因克隆及其功能的初步研究(4):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_96684.html