进一步筛选蛋白功能未知的、基因成员在20个以上的家族，基因转录模式为：在侵染过程中高表达，最终确定研究的OGS_154821家族。

1。2  提取质粒及农杆菌转化

1。2。1  大肠杆菌质粒提取

使用AXYGEN公司的质粒提取试剂盒：

1)取4 mL在LB培养基中培养过夜的菌液12000 rpm离心1 min，弃上清；

2)加入250 µL Buffer S1(已加入RNase A)悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小菌块；

3)加入250 µL Buffer S2温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的菌液；

4)加入350 µL Buffer S3温和并充分地上下翻转6-8次，12000 rpm离心10 min；

5)吸取步骤4中的上清，加入配套的离心柱中，12000 rpm离心1min，弃滤液；

6)将制备管放回离心管，加500  Buffer W1,12000 rpm离心1 min，弃滤液；

7)将制备管放回离心管，加700  Buffer W2,12000 rpm离心一次；

8)将步骤7重复一次；

9)空甩离心柱12000 rpm，1 min；

10)将制备管放入新的1。5 mL的离心管中，在制备管中加60-80 无菌水，室温静置1 min，12000 rpm离心1 min，得到的即为质粒。

1。2。2   农杆菌转化

1。2。2。1   农杆菌GV3101感受态制备

1)从-70℃冰箱中取出GV3101甘油菌，用接种针在不含抗生素的LB平板上划线，30℃培养48 h，生长出单菌落。 

2)牙签点新菌落于4 mL LB培养液中30℃ 200 rpm振荡培养2 d，取3 mL培养液于200 mL三角瓶中150 rpm振荡培养8 h至OD600=0。8后，冰上放置10 min。 

3)分装入50 mL离心管中，天平平衡，5,500 rpm 4℃离心10 min。 

4)弃上清，10 mL 100℃灭菌超纯水重悬，重悬尽量彻底无小块沉淀。天平平衡，5,500 rpm 4℃离心10 min。 

5)重复4过程3次。 论文网

6)弃上清，加入2 mL 15％的甘油，用移液器轻轻吸打使细胞重悬。 

7)冰上分装100 µL细胞重悬液于预冷的1。5 mL EP管中。 

8)液氮速冻，于-70℃冰箱保存备用。

1。2。2。2  电击法转化农杆菌

1)取农杆菌(GV3101)感受态置于冰上，加入已经冰浴冷却的质粒或目的片段与质粒的连接产物，轻轻吸打均匀后转移到预冷的电击杯中；

2)2500 V电压电击后迅速取出电击杯，加入800  LB液体培养基，迅速吸打混匀后将菌液转移到1。5 mL EP管中，30℃，200rpm振荡培养1 h；

3)室温下5000 rpm，离心3 min，去除上清留下100 与沉淀混匀，在相应抗性的LB平板培养基上涂板，30℃倒置培养36-48 h；

4)转化鉴定：PCR验证阳性克隆。

1。3  RNA提取，逆转录和定量过程

1。3。1  RNA的提取（Invitrogen，DP320）

1)取1。5m EP管加入500µL TPK裂解液与10µL β-巯基乙醇；

2)取适量样品充分压干，加入液氮重恩碾磨，将研磨后的粉末加入前一步骤准备的裂解液中，震荡30s，室温放置；

3)低温离心机4℃ 14000rpm 离心10min，吸取800µL上清于新的1。5mL EP管中；

4)加入等体积的（400µL）的70% 无水乙醇。

5)混合液分两次加入离心柱中离心，4℃ 10000rpm离心30s。

6)向离心柱中加入300µL wash Buffer I，4℃ 10000rmp离心30 sec。离心后换用新的2mL EP管。

7)向离心柱加入500µL wash Buffer II（使用前要检查是否已加入无水乙醇），4℃ 10000rpm离心15sec。

8)重复步骤7。

9)弃离心液，空离，10000rpm离心1min。

10)将离心柱放入新的1。5mL EP管，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 µL DEPC水，在室温下放置1min，10000rpm离心1min。 新的大豆疫霉分泌蛋白家族的生物信息学鉴定及功能分析(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_96689.html