Hsp70又分为组成性表达的Hsp70和对压力响应的诱导型热激蛋白。在本文中，我们将对食用甲鱼诱导性Hsp70的克隆和表达进行详尽描述，研究发现Hsp70在不同组织中表达水平不同。孵化温度对Hsp70表达水平影响较小，但是其表达水平受细菌感染的影响显著。

2. 材料与方法

2.1菌株和培养条件

致病菌嗜水气单胞菌TL1是从来自中国浙江某个食用甲鱼厂中的一只生病的食用甲鱼的肝脏中分离得到的。TL1的培养是在28℃条件下的LB培养基中进行的。大肠杆菌Dh5α购买自北京全式金公司，在LB培养基中的28℃条件下培养的。

2.2食用甲鱼的孵化

食用甲鱼受精的蛋购自中国浙江杭州某孵化场，并用电子天平称量精度至±1 mg。这些鳖蛋被随机放进含有潮湿的蛭石的孵化盒中，每盒8只蛋。分别将这些孵化盒放进设置了不同温度的孵化箱中。孵化盒在孵化箱的不同位置周期性的变换以减小孵化箱中的温度梯段的影响。每周两次检查这些鳖蛋并在孵化盒中加入适量的水以保持蛭石的潮湿。

2.3 基因的序列鉴定和分析

2.3.1 基因的扩增

依据基因库中的食用甲鱼Hsp70的序列，设计食用甲鱼Hsp70特异性引物PsHsp70 F1和PsHsp70 R1（见表 1），其中下划线序列是EcoRⅤ酶的位点，以食用甲鱼肝脏的cDNA为模板，PCR获得食用甲鱼Hsp70的基因序列。

表 1 基因扩增引物序列

引物名称 引物序列（5’-3’）a

PsHsp70 F1 CATATGATATCGCCACCATGTCCGGCAAAGCGCCT

PsHsp70 R1 CTCGAGATATCGTCGACTTCTTCAATGGTTGGT

PsHsp70 RTF1 GCTTGACAAATGCCAGGAGGT

PsHsp70 RTR1 TGTGACGATAGGGTTGCAGAGT

IRG F1 CTACTTGGCAGTACATCTACGT

IRG R1 GACGGCAATATGGTGG来,自|优;尔`论^文/网www.youerw.com T

(1)25 μl PCR反应体系如下：

Template              0.5 μl

PsHsp70 F1            0.2 μl

PsHsp70 R1            0.2 μl

dNTP                   4μl

Buffer                 2.5μl

Taq                   0.2μl

H2O              up to 25μl

(2)PCR反应条件如下：

94 ° C 5 min

94 ° C 30s

61 ° C 90s    5 cycles

72 ° C 60s

94 ° C 30s

68 ° C 90s.   25 cycles

72 ° C 60s

72 ° C 10min

2.3.2 TA克隆

2.3.2.1 PCR产物回收纯化---胶回收

在紫外灯下割胶回收PCR产物，胶回收步骤参照OMEGA胶回收试剂盒使用说明进行，具体操作步骤如下：

(1) 在Washing Buffer中加入100ml的无水乙醇，并混合均匀待用；

(2) 向装有凝胶的离心管中加500μl Binding Buffer，置55℃水浴锅中7min融胶；

(3) 将以上溶液转至柱子中，室温放置2min；

(4) 静置后10000rpm，1min；

(5) 再重复步骤3、4，弃收集管中的废液；

(6) 往上述管中加300μl Binding Buffer，10000rpm，1min，弃废液；

(7) Hsp70过量表达对食用甲鱼细菌感染死亡率的影响(3):http://www.youerw.com/shiping/lunwen_80891.html