2。2。2 醇腈酶的克隆及质粒构建 12

2。2。3 诱导表达和条件From优T尔K论M文L网wWw.YouERw.com 加QQ75201^8766 优化 12

2。2。4 菌体收集与细胞破碎 13

2。2。5 电泳样品的制备 13

2。2。6 蛋白质 SDS-PAGE 凝胶电泳 13

2。3 分析方法 14

2。3。1 蛋白浓度的测定 14

2。3。2 酶活的测定 14

3 结果与讨论 15

3。1 不同诱导浓度对酶活力的影响 15

3。2  不同培养温度对酶活力的影响 16

3。3 不同诱导时间对酶活力的影响 18

3。4 不同诱导时机对酶活力的影响 19

4  实验总结 21

参考文献 22

致谢 24

1 前言

羟基腈裂解酶(Hydroxynidtrile Lyase,HNLs)又称醇腈酶，是一种广泛存在于高等植 物中的裂解酶，是植物抵抗食草动物和真菌侵袭的有力武器。据研究发现，醇腈酶在植物体 内用于分解氰醇产生氢氰酸（HCN）,该现象也被称为植物的生氰作用[1-2]。同时，醇腈酶论文网

能可逆地催化 HCN 和醛(酮）类化合物反应生成手性氰醇化合物（如图 1）。氰醇作为大 量手性化合物的合成子，在不对称合成中有着广泛而重要的应用，光学活性氰醇化合物是药 物和农药的结构单元。其中，最具代表性的有β-类肾上腺素阻断剂和拟除虫菊酯的合成。

醇腈酶作为一种生物催化剂，与化学催化剂相比具有反应条件温和、副反应少、光学纯度高、 效率高以及环境友好等优点，醇腈酶也由此成为现今研究热点。迄今,人们已从动植物中纯 化 到 18 种 HNL[3-5], 但 在 有 机 合 成 中 具 有 应 用 前 景 者 主 要 包 括 木 薯 HNL(Manihot esculenta,Me- HNL) 、 三 叶 胶 HNL(Hevea brasiliensis, He-HNL) 和 来 自 蔷 薇 科

（Rosaceae）的 HNL。

图 1 醇腈酶催化制备手性腈醇反应方程式

Fig1 Reaction equation for chiral cyanohydrin catalyzed by Hydroxynidtrile Lyase

根据有无黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），将羟基腈裂解酶基本分为两类：氧化还原酶 类和α/β水解酶类。FAD 作为多数氧化还原酶的辅基，广泛参与体内各种氧化还原反应，在 生物氧化系统中起传递氢的作用。FAD 的缺失可能会引起酶的失活，有些可以对羟基腈裂 解酶的结构起到稳定的作用，而有些则是进化过程的残留。目前，含有 FAD 的羟基腈裂解 酶已经从一类属于苹果亚科（Maloideae）、李亚科（Prunoideae）和蔷薇科（Rosaceae） 的植物种子中提取出来，而且证实对植物的产氰作用有重要作用[6]。另一类缺乏 FAD 的醇 腈酶属于α/β水解酶，可以从高粱属、木薯、亚麻等植物中被大量提取。醇腈酶具有不同的 糖基化、结构和氨基酸序列等物理化学性质（表 1）。

自然界的醇腈酶分为 R 构型和 S 构型两种，其与催化产生的氰醇的 R 型和 S 型相关。 目前，已分离纯化并进行酶活分析的 R 型羟基腈裂解酶多来自于蔷薇科植物，如扁桃、黑

樱桃、梅、枇杷、西番莲等[7-8]；而 S 型羟基腈裂解酶多来自于木薯、橡胶树、高粱与海檀 木[9-11]。例如，在橡胶醇腈酶（HbHNL）与手性底物结合体的晶体结构中，发现仅有 S 型 底物被结合。这也了证明醇腈酶与底物醛（酮）作用通常只产生单一构型的氰醇，即醇腈酶