透明质酸酶大肠杆菌表面展示体系的构建(4)
1.1.4 透明质酸酶的应用
透明质酸酶在疾病的诊断和治疗过程中具有广泛的应用前景。临床用作药物渗透剂，促进药物的吸收，促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散。
在眼科手术中，透明质酸酶作为局部麻醉的辅助用药可增加组织的通透性，使药物易于扩散从而增强麻醉效果[24]。研究表明，恶性肿瘤细胞内透明质酸和透明质酸酶的含量明显升高[25]，因此透明质酸酶可作为理想的肿瘤标记物，在肿瘤诊断中具有很高的灵敏性和特异性。另外，透明质酸酶对透明质酸的降解作用还在治疗肠粘连、减轻缺血损伤、缩小心肌梗死范围及受精过程中发挥了重要作用。在基础研究方面，透明质酸酶以及其他的多糖水解酶也是很好的工具酶，可用于多糖的研究以及用来制备寡聚多糖。随着人们对HA、低分子HA及HA寡糖生物学意义重要性认识的不断深入，越来越多的证据表明，低相对分子质量HA及HA寡糖的生物活性与HA显著不同，近年很多研究人员都开始进行酶法降解HA制备寡糖的研究，分离纯化出单一的寡糖，从而可以进一步对其生物学意义进行研究。目前透明质酸酶产品主要从哺乳动物（牛、羊）睾丸组织中提取。此过程复杂费时，需经制浆、提取、吊滤、盐析、透析、过滤、抽滤及冷冻等过程，易导致产品纯度低，杂蛋白含量多，免疫原性较强，且来源受环境限制的影响，不利于透明质酸酶产品的应用及工业化大规模生产。
1.2 细菌表面展示体系的概述
细菌细胞表面展示(bacterial cell surface display)是指通过重组DNA技术，将外源功能蛋白表达并定位于特定细菌细胞的表面，从而达到一定的研究与应用目的[8]。外源蛋白的这种表面锚定不仅可以使特定的反应在细胞表面直接发生而提高反应效率，并能克服某些大分子底物不能穿越细胞膜而进入胞内，以及某些反应产物在细胞内不能进行特定的构型折叠等弊端，而且还可以使产物的提取纯化过程简化。自1986年Freudl等首先报道细菌表面展示技术后，经过20余年的研究和开发，这一技术获得长足的发展，现已被应用于活体疫苗开发、蛋白质及多肽文库筛选、抗体合成、生物传感器研制、全细胞生物催化剂和生物吸附剂等领域，新的应用领域仍在不断的涌现[21]。
目前有多种细菌表面展示系统可供利用, 除了以往对细菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面附属结构亚单位如鞭毛、菌毛等研究较多外, 近几年又开发出多种新的表面展示系统。研究较多的有冰晶核蛋白( INP )[18]、自体转运蛋白、S-层蛋白等。此外, 尚有研究利用枯草杆菌的芽胞外膜, L-型大肠杆菌和变形杆菌的细胞膜来展示外源蛋白。每种展示系统都有其自身的缺点,例如展示蛋白大小的限制, 错误定位, 形成包涵体,外膜不稳定等, 因此需要开发新的系统, 以进一步优化表面展示系统。这里介绍目前应用较多的冰晶核蛋白和自体转运蛋白[13]。INP是一种膜蛋白, 发现于欧氏杆菌、假单胞杆菌和黄单胞菌属。在过冷的水中, 它能使宿主细胞形成冰晶核。INP由N 端结构域、C 端结构域及中央结构域组成。其中N 端结构域负责锚定于细胞表面, 中央结构域是由8-、16-、48 个残基周期性组成的重复结构, 是冰晶核形成的模板。已经有几种INP的呈现系统得到应用, 如INP全长序列, 只包括N-和C-末端的序列INP-N，INP-NC 加上内部重复单位以及N 端( INP-N )加上内部重复单位。INP的优点包括： 稳定的表达和外膜转运；内部重复单位长度可调整, 可借以调节外源蛋白和膜表面之间的距离； 通过冰晶核形成活性试验可检测异源蛋白是否表达在细胞表面； 表达INP融合蛋白不影响膜的结构和宿主细胞生长；INP可在多种革兰氏阴性菌中表达, 并可呈现大分子蛋白。自体转运蛋白包括多种与革兰氏阴性菌毒力有关的蛋白, 其功能主要是粘附和水解蛋白质。其特征是运输至细胞外膜和通过外膜分泌所需要的所有信息都集中在蛋白本身, 不需要其它蛋白的参加, 就能将外源蛋白转运通过革兰氏阴性菌细胞外膜,并将其在细胞表面稳定展示。经典的自体转运蛋白运输机制是, 首先N-端信号肽藉助Sec-依赖途径运输蛋白通过细胞质膜到达周质腔, 接着C-端部分在外膜组装成β折叠管, 外源蛋白通过由β折叠管形成的通道定位。最早发现的自体转运蛋白是奈瑟氏菌属的IgA蛋白酶, 目前已发现40种具有自体转运蛋白特征的蛋白, 应用较多的为大肠杆菌AIDA-I ,此外还有大肠杆菌Ag43,志贺氏菌属的VirG, 沙门氏菌的MisL等。许多研究结果表明, 自体转运蛋白是展示外源蛋白的理想工具, 因为其呈现系统不需要其他蛋白的参与, 且能转运较大分子量的蛋白, 并保持它们的抗原性和生物学功能。
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