灵芝bZIP转录因子对灵芝生长发育及次生代谢的影响(3)
1.1.1 菌株、质粒和试剂
灵芝（Ganoderma lucidum HG）菌株G20来自上海农科院，大肠杆菌DH5α储存于本实验室。质粒pMD18-T vector购自大连Takara公司。溶壁酶购自广东省微生物研究所。Taq DNA polymerase、T4 DNA ligase、M-MLV反转录酶、RNAiso plus提取剂等均购自大连Takara公司。SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、所有抗生素均购自上海生工生物工程公司。其它化学试剂均来自Sigma公司或为国产分析纯。
1.1.2 菌株培养
1.1.2.1 大肠杆菌DH5α的培养
大肠杆菌DH5α于LB培养基在37℃下培养，-70℃保存。LB培养基配方见附录。
1.1.2.2 灵芝菌株G20的培养
灵芝菌株于PDA培养基或CYM培养基在28℃下培养，菌种接于PDA固体斜面培养基4℃保存。PDA培养基和CYM培养基配方见附录。
1.1.3 主要仪器
ABI 2720型PCR仪，Eppendorf realplex2荧光定量PCR仪，Eppendorf Centrifuge 5417R型台式低温高速离心机，DYY-10C型电泳仪，DYCZ-20B型电泳槽，凝胶电泳成像仪，EclipseTi-S光学显微镜，7231型分光光度计，组织粉碎机，28℃恒温培养箱，冰箱，超低温冰箱，超净工作台，水浴锅。
1.2 实验方法
1.2.1灵芝bZIP家族转录因子的系统性筛选
通过blast软件将部分真菌bZIP家族转录因子与灵芝全基因组本地数据库进行blastP分析；将初步筛选的结果（E值<10-5）与NCBI网站上的非冗余蛋白数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行反向blastP，进一步确认筛选序列与bZIP家族的同源性。
1.2.2 灵芝bZIP家族转录因子基因的生物信息学分析
通过一些生物学软件和在线网站，对灵芝bZIP转录因子进行了一系列研究相关的生物信息学分析。
通过NCBI网站blast功能（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）对蛋白质序列进行相似性比对；利用网站（http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）对bZIP家族蛋白质进行分子量及等电点预测；对灵芝bZIP家族转录因子蛋白质序列的功能域分析通过网站（http://smart.embl-heidelberg.de/）实现；通过网站（http://linux1.softberry.com/）对灵芝bZIP转录因子进行亚细胞定位预测；使用MEGA6.0软件对相关序列进行聚类分析，并生成系统进化树。灵芝基因组数据来自网站（http://genome.jgi.doe.gov/cgi-bin/metapathw
ays?db=Gansp1）。用于初步比对筛选的酿酒酵母bZIP转录因子蛋白序列来自酵母基因数据库（http://www.yeastgenome.org/）。灰盖鬼伞（Coprinus cinereus）和褐腐菌（Postia placenta）的bZIP转录因子序列来自真菌转录因子数据库（ftfd.snu.ac.kr/index.php?a=view）。
1.2.3 灵芝bZIP家族转录因子沉默质粒的构建
1.2.3.1 灵芝bZIP家族基因沉默片段的PCR扩增
运用软件Primer 5设计灵芝bZIP家族基因沉默引物GlbZIP-KpnI-F和GlbZIP-SpeI-R，并以灵芝bZIP基因cDNA为模板扩增灵芝bZIP家族基因沉默片段。