油菜天然抗性巨嗜蛋白（BnNRAMP）的筛选与基因克隆(3)
TRIzol：购自南京聚雄华生物技术有限公司 (Invitrogen) ；
DEPC：购自南京寿德实验器材有限公司；
EB (10mg/mL) ：购自南京寿德实验器材有限公司；
琼脂糖：购自BIOWEST公司；
DNA消解试剂盒：购自Thermo公司；
反转录试剂盒 (TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix) ：购自北京全式金生物技术有限公司；
Phusion®超保真DNA聚合酶 (Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase) ：购自NEB公司；
pEASY-Blunt Simple克隆载体：购自北京全式金生物技术有限公司；
琼脂糖凝胶回收试剂盒：购自GENRAY公司；
质粒小量制备试剂盒：购自GENRAY公司；
限制性内切酶SpeI, BamHI, NotI：购自NEB公司；
T4 DNA 连接酶：购自TAKARA公司；
DNA marker：购自GENRAY公司；
氯仿、异丙醇和无水乙醇；
50×TAE 缓冲液 (Tris, Na2•EDTA•2H2O, 乙酸) 。
1.2 实验方法
1.2.1 BnNRAMP基因家族筛选方法
利用Tair transpoter family获得NRAMP家族的Domain Accession，再借助SMART和Pfam网站获得这些结构域的hmm文件。之后，通过hmmer软件（v3.0），从TAIR和Brassica Datebase两个数据库中初筛得拟南芥中和油菜中含有结构域的蛋白基因，再经过MEGA软件（v5.0）去除冗余，并再次通过Pfam和SMART进行验证。最终所得基因序列经由clustalX和GENEDOC软件进行序列比对与进化树制作