氯化钾提高玉米茎腐病的蛋白质组学分析(3)
1 材料与方法 （仿宋体四号）
1．1 实验材料
本研究采用的实验材料是玉米抗茎腐病菌品种“吉单180”。玉米侵染菌种为禾谷镰刀菌（Fursarium graminearum）。在25℃条件下，通过盆栽，营养液水培，在幼苗成长至一月大小时，采用禾谷镰刀菌（Fursarium graminearum）对其茎部针刺注射悬浮液，进行侵染，侵染过程中禾谷镰刀菌接种量保持一致，同时取另一组施加KCl，KCl的浓度为5mM，当侵染7天时，分别取接种侵染的和接种侵染加KCl的玉米茎部作为实验侵染组样品，同时取正常生长（非侵染）实验为对照组样品，实验设两次重复，取材后立即放入液氮速冻，然后转入超低温度冰箱保存，待蛋白质组学分析用。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 主要仪器
冷冻离心机 (Eppendorf)、ImageScanner扫描仪（GE Healthcare）、真空冷冻干燥机(Thermo savant)、Eksigent nanoLC-Ultra™ 2D系统(AB SCIEX)、分析型液相色谱Agilent 1200（Agilent）、Q Exactive 质谱仪(Thermo Scientific)、超声波细胞粉碎仪、水浴锅、天平、紫外分光光度计、Eppendorf 冷冻离心机 (Eppendorf)、涡旋振荡器、水浴锅、恒温孵浴器。
1. 2. 2 主要试剂
尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、二硫苏糖醇（Dithiothreitol, DTT）、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）、碘乙酰胺（Iodacetamide, IAA）、IPG Buffer、甲酸（Formic acid）、甲酸铵购自GE公司；十二烷基磺酸钠（SDS）、三羧基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、三氯乙酸（Trichloroacetic acid, TCA）、 过硫酸铵（Ammonium persulfate, APS）、 碳酸钠、N,N,N',N'-四甲基二乙胺（TEMED）均购自Amresco公司；蛋白酶抑制剂（PMSF）购自Sigma公司；胰蛋白酶（Trypsin Gold）购自Promega公司、乙腈（Acetonitrile, CAN）、色谱水等购自Thermo fish；iTRAQ 8 plex 试剂盒 (AB SCIEX)、Tris-HCl（pH 6.8、 pH 8.5、 pH 8.8）、考马斯亮蓝G-250、溴酚蓝（Bromophenol blue）、 丙酮、甲醇、乙醇、NH₃•H₂O 、蛋白浓度测定试剂盒。其它试剂均为国产分析纯。
1. 2. 3 玉米幼苗茎部总蛋白质提取
（1）称取0.5 g样品与预冷的研钵中，加入液氮研磨粉碎（研磨过程中加入适量PVP）；
（2）将磨好的样品放入50 mL离心管中，加入-20℃预冷的10% TCA-丙酮溶液(含0.1% DTT和1 mM PMSF)，-20℃静置2 h；
（3）4 ℃，12000 rpm/min，离心20 min，弃上清；
（4）在沉淀物中加入-20 ℃预冷的丙酮溶液(含0.1% DTT和1 mM PMSF)，用玻璃棒将沉淀捣碎，-20℃静置1 h。静置过程中涡旋一次；
（5）4℃，12000 rpm/min，离心20 min，弃上清；
（6）重复（4）（5）步骤，根蛋白一次，叶片蛋白两次；
（7）用滤纸封住管口，将沉淀物放入冷冻真空干燥机中干燥20分钟；
（8）将干燥的蛋白粉末至于-40℃冰箱中保存备用。
1. 2. 4 总蛋白酶解
（1）根据蛋白定量结果取100 μg蛋白样品加入到1.5 mL的离心管中，定容至30 μL，并做好标记。
（2）向每管样品中加入4倍体积（120 μL）的还原剂，充分涡旋混匀，短时离心将粘在管壁上的蛋白溶液离到管底，然后37℃水浴1 h。
（3）加入与还原剂等体积（120 μL）的烷基化试剂，涡旋混匀，室温避光放置10～15 min。
（4）取新的超滤管（10kD），然后将还原烷基化后的样品转移至对至对应的超滤管中，4℃，12000g，40 min，将未反应液体全部离心下去。
（5）向每个超滤管中加入50 μL 的TEAB1，4℃，12000g，30min，直至超滤管中的液体全部离心下去。
（6）取出超滤管，弃掉收集管底部溶液，然后向每管中加入150 μL的Buffer ，4℃，12000g，40 min。