和缓艾美尔球虫1A蛋白基因的克隆表达(2)
1A蛋白的基因序列为NADH依赖性的转氢酶的一部分，其氨基酸序列中有与甘露糖醇及支链淀粉转运有关联的己糖转运蛋白序列[8-9]。研究发现许多疾病与1A蛋白的表达有关。因而通过对该基因克隆表达，制备DNA疫苗可能达到防止或降低鸡的球虫感染，缓解增重下降，提高养禽的效益。
本实验在实验室前期研究的基础上选择目的基因1A蛋白基因进行克隆、表达并对其免疫原性进行分析，为进一步研究和缓艾美耳球虫的基因疫苗奠定基础。
1 材料与方法 1. 1 材料
1. 1 .1虫株
和缓艾美耳球虫虫株由南京农业大学兽医寄生虫病学实验室保存，用和缓艾美耳球虫纯种孢子化卵囊(1.0 ×105 /只)接种40只雏鸡, 5-7d收集鸡的粪便，然后收集纯化球虫卵囊, 将纯化的卵囊孢子化。
1.1 .2 菌种、载体和主要试剂
表达宿主菌BL21（DE3）由南京农业大学兽医寄生虫研究室提供，载体基因是由江苏通用生物公司提供的pSmart-I。DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker 、LA Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶Not1、BamHⅠ、BSA、10×K等均为宝生物工程（大连）有限公司产品。DNA凝胶回收试剂盒为美国Axygen产品。蛋白纯化试剂盒为GE公司的产品。His Taq亲和层析蛋白纯化柱（GE公司生产）；Thermo蛋白质预染Marker。
1. 1. 3 本实验所用溶液的配置
琼脂糖电泳缓冲液：10×TBE Buffer：称取硼酸55 g， Tris 108 g，Na2EDTA•12H2O 7.44g，加入约 900 mL的去离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，室温保存。使用时20倍稀释。
1%琼脂糖凝胶：将0.3 g的琼脂糖，加入30 mL 0.5×TBE Buffer中溶解，用微波炉将其煮沸至完全溶解，冷却约至50 ℃（置于手背感觉不烫）时倒入插好梳子的模具中，根据实际需要调整凝胶的总量和模具。
氨苄青霉素(Amp)：将 2.5g Ampicillin 加入50 mL离心管中，在超净台中把20 mL灭菌蒸馏水加到离心管中，充分溶解后震荡混匀，定容至25 mL，用 0.22 µm滤膜过滤除菌以及杂质，用2mL的EP管分装，每管1.5mL，然后装入塑封袋，标明试剂的名称和日期，-20 ℃冻存备用。
LB(Luria-Bertani)培养基
LB液体培养基：5g YEAST EXTRACT，10g NaCl ，10g TRYPTONE，加入到约800 mL去离子水中，充分搅拌溶解，定容至1L，根据需要分装到不同的容器中，常规高压灭菌后，4 ℃保存备用。
LB固体培养基：琼脂糖按 1.5 g/100mL加入LB液体培养基中，动锥形瓶使琼脂充分混匀，装入锥形瓶，高压灭菌。摇冷却到可以用锥形瓶接触手背，在超净台中加入氨苄青霉素，摇动容器充分混匀，倒入平板。倒完约2个小时，将平板盖好，用封口膜封好，4℃冰箱保存备用。
0.1 mol/L CaCl2溶液：称取10.8g CaCl2•H2O加入100 mL的去离子水中，充分溶解后定容至200mL，常规高压灭菌后4 ℃保存。
1×PBS 缓冲液：将 NaCl 8g，KCl 0.2 g，Na2HPO4•12H2O 3.5814 g，KH2PO40.24 g溶于去离子水800 mL。加水定容至1L，高压灭菌。
IPTG：将 2.5 g IPTG 在超净台中溶于8mL 灭菌dd中，充分溶解后定容至10 mL，用 0.22 µm滤膜过滤除菌和杂志，用2mL的EP管分装，每管1.5mL，装入塑封袋，标明试剂名称和日期，-20 ℃冻存备用。
1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）：称取Tris90.75 g，溶于400 mL蒸馏水中，用1mol/L HCl 将其pH调至 8.8，加水定容至500 mL，4 ℃冰箱保存。
10% SDS (w/v)：称取SDS 10 g溶于蒸馏水中，待其充分溶解，然后定容至100 mL，室温储存备用。
10%APS(w/v)：APS 0.1 g充分溶解于1mL蒸馏水中，每天现配现用。
0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）：准确称取 Tris12 g，溶于120 mL蒸馏水中，用1mol/L HCl 调节其pH至6.8，加水定容至200 mL，4 ℃冰箱保存。