1.3.3  绿盲蝽总RNA的提取
参照Invitrogen TRIzol® Reagent 试剂盒说明提取绿盲蝽成虫总RNA。
取5头羽化3~5天的绿盲蝽成虫,加入液氮研磨粉碎后,每50mg组织中加1000μl TRIzol试剂抽提研磨混匀;12000g 4℃离心15min,弃沉淀,取上清液到新EP管中,室温静置5min;每管加入200μ1氯仿,剧烈振荡30s,室温静置10min;12000g 4℃离心15min,取500μ1上清转移到新的EP管中;加500μ1异丙醇,轻轻混匀,室温静置10min;12000g 4℃离心10min,迅速弃上清液;加1000μl 75%乙醇,短暂涡旋,12000g 4℃离心10min,弃上清液;加DEPC水40μl重新溶解RNA,并于-80℃保存备用。
1.3.4  RNA质量检测
用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取质量,电泳条件:120V,20min。利用凝胶成像系统进行拍照,确认总RNA完整性。利用Nanodrop100核酸蛋白定量仪测定RNA的浓度和纯度。RNA样品于-80℃保存,备用。
1.3.5  定量反转录
利用PrimeScript® RT Reagent 试剂盒合成第一链cDNA。
为了准确地进行基因表达量分析,必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件,但总RNA重常常混有基因组DNA,并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增,因此会造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生,需要对总RNA样品进行DNase I 处理,以除去残存的基因组DNA。
首先进行基因组 DNA 的除去反应:反应体系为10.0μl体系,取总RNA 约1μg,加入5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl,gDNA Eraser 1.0μl,最后加RNase Free dH2O至10.0μl,在室温下静置5min。(得到的反应液4℃下短期保存,-20℃下长期保存)
然后进行反转录反应(反应液配制在冰上进行):反应体系为20.0μL体系,取基因组DNA除去反应后得到的反应液10.0μl,加入5×PrimeScript® Buffer 2(for Real Time) 4.0μl,PrimeScript® RT Enzyme Mix I 1.0μl,RT Primer Mix 1.0μl,最后加RNase Free dH2O至20.0μl。反应程序为:37℃反转录15min;85℃反转录酶失活5s。(得到的反应液4℃下短期保存,-20℃下长期保存)
1.3.6  荧光实时定量PCR
实时定量PCR体系参照Tkara公司产品PrimeScript®  RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)说明书,仪器为ABI Prism 7500 Fast Real-Time PCR System。
反应体系为20μL体系,包括SYBR®Premix Ex TaqTM II 10μL、dH2O 7.2μL、cDNA 2μL,上下游引物各0.4μL(表1)。(反应液配制在冰上进行)反应程序为:95℃预变性30s;按以下条件40个循环:95℃,5s;60℃,34s。用ABI Prism 7000 SDS1.1(sequenee detector system,美国应用生物系统公司)软件进行数据记录分析和产生熔解曲线,阈值线通常由软件自动设定。每个品系取三个样,每个样至少重复三次。用灭菌超纯水代替cDNA模板作为空白对照,至少重复五次。
实验预先进行扩增效率和融解曲线试验,以确定目标基因和内参基因的引物特异性及扩增效果。本实验采用比较CT法来测定目标基因的相对表达量,其数学公式表示为目的基因的量=2-△△CT,CT值为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,△△CT=(CT目标基因-CT 内参基因 )实验组-(CT目标基因-CT内参基因)对照,2-△△CT来表示相对于对照组的变化倍数(Livak and Schmittgen,2001)。
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