绿盲蝽毒死蜱抗性品系中P450基因相对表达量的变化(3)
1．3．3 绿盲蝽总RNA的提取
参照Invitrogen TRIzol® Reagent 试剂盒说明提取绿盲蝽成虫总RNA。
取5头羽化3～5天的绿盲蝽成虫，加入液氮研磨粉碎后，每50mg组织中加1000μl TRIzol试剂抽提研磨混匀；12000g 4℃离心15min，弃沉淀，取上清液到新EP管中，室温静置5min；每管加入200μ1氯仿，剧烈振荡30s，室温静置10min；12000g 4℃离心15min，取500μ1上清转移到新的EP管中；加500μ1异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min；12000g 4℃离心10min，迅速弃上清液；加1000μl 75％乙醇，短暂涡旋，12000g 4℃离心10min，弃上清液；加DEPC水40μl重新溶解RNA，并于-80℃保存备用。
1．3．4 RNA质量检测
用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取质量，电泳条件：120V，20min。利用凝胶成像系统进行拍照，确认总RNA完整性。利用Nanodrop100核酸蛋白定量仪测定RNA的浓度和纯度。RNA样品于-80℃保存，备用。
1．3．5 定量反转录
利用PrimeScript® RT Reagent 试剂盒合成第一链cDNA。
为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但总RNA重常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，需要对总RNA样品进行DNase I 处理，以除去残存的基因组DNA。
首先进行基因组 DNA 的除去反应：反应体系为10.0μl体系，取总RNA 约1μg，加入5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl，gDNA Eraser 1.0μl，最后加RNase Free dH2O至10.0μl，在室温下静置5min。（得到的反应液4℃下短期保存，-20℃下长期保存）
然后进行反转录反应（反应液配制在冰上进行）：反应体系为20.0μL体系，取基因组DNA除去反应后得到的反应液10.0μl，加入5×PrimeScript® Buffer 2（for Real Time） 4.0μl，PrimeScript® RT Enzyme Mix I 1.0μl，RT Primer Mix 1.0μl，最后加RNase Free dH2O至20.0μl。反应程序为：37℃反转录15min；85℃反转录酶失活5s。（得到的反应液4℃下短期保存，-20℃下长期保存）
1．3．6 荧光实时定量PCR
实时定量PCR体系参照Tkara公司产品PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)说明书，仪器为ABI Prism 7500 Fast Real-Time PCR System。
反应体系为20μL体系，包括SYBR®Premix Ex TaqTM II 10μL、dH2O 7.2μL、cDNA 2μL，上下游引物各0.4μL（表1）。（反应液配制在冰上进行）反应程序为：95℃预变性30s；按以下条件40个循环：95℃，5s；60℃，34s。用ABI Prism 7000 SDS1.1(sequenee detector system，美国应用生物系统公司)软件进行数据记录分析和产生熔解曲线，阈值线通常由软件自动设定。每个品系取三个样，每个样至少重复三次。用灭菌超纯水代替cDNA模板作为空白对照，至少重复五次。
实验预先进行扩增效率和融解曲线试验，以确定目标基因和内参基因的引物特异性及扩增效果。本实验采用比较CT法来测定目标基因的相对表达量，其数学公式表示为目的基因的量=2-△△CT，CT值为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，△△CT=(CT目标基因-CT 内参基因 )实验组-（CT目标基因-CT内参基因）对照，2-△△CT来表示相对于对照组的变化倍数（Livak and Schmittgen，2001）。