长三角地区蜻蜓目均翅亚目稚虫分类研究(3)
⑺将吸附柱重新放回收集管中，于12000rpm室温离心2min，离去残留的CW2 Solution。
⑻取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50ul CE Buffer静置3 min，12000rpm室温离心2min，收集DNA溶液，提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
1.4.2.2 PCR扩增
⑴ 引物
表1 用于PCR扩增的引物
引物名称 序列（5’—3’） 引物出处
LCO1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG Folmer et al.1994[12]
HCO2198 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
⑵ PCR反应体系
Mix 12.5ul，引物各2ul，ddH2O 6.5ul，模板2ul。
2.分子生物学研究
2.1数据来源
从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov的GenBank Home中下载相关的COI基因序列[13]以及一个外种群序列。
2.2序列拼接和编辑
将得到的双向测序结果运用sequencer4.5软件进行序列拼接和序列编辑，将拼接好的序列在NCBI的BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）中的Nucleotide BLAST中进行同源性搜索（一般同源性要大于80%）[14]。
2.3基因树的构建
将原有稚虫的序列和搜索到的序列放入同一个fasta文件中，利用MEGA5.0（Tamura et al，2011）[15]对COI序列进行比对分析，去除两端多余的部分，保留共有序列。将得到的结果保存为mas格式，再次运用MEGA5.0软件进行基因树的构建，一般采用邻接法（NJ）构建进化树，利用分子数据证明检测到的稚虫分类情况。
3、结果与分析
3.1进化树的分析
本文章共分析了4条COI序列，周欣等人（2007）认为COI序列测定的种内距离是非常显著的[16]。