缺氧条件下HIF与P53通路间关系研究(2)
HIF-1a包括2个核定位序列，分别位于N端的bHLH结构域内(17 -33)和C端(718-721)，HIF-1a的稳定性主要通过氧气依赖降解域调(401-608)。而它的转录活性通过两个转录激活域(TADs)被促进，TADs分别为C端的TAD (C-TAD786-826)和N端TAD(N-TAD531-575)[5]。在正常氧张力下，HIF-1a的合成和降解同时发生，但是在氧气依赖的蛋白水解酶作用下，被迅速降解，导致它的半衰期及其短暂不超过5分钟，通常很难检测到HIF-1a蛋白质，因此它保持在低稳态水平[6]。
脯氨酸和天冬氨酸羟化酶作为氧气的传感器，感知细胞内氧气浓度的变化。脯氨酸羟化酶(PHDs)羟基HIF-1a的氧气依赖降解域内的两个脯氨酸残基Pro402、Pro564，肿瘤抑制蛋白质pVHL识别羟基化的脯氨酸残基，靶标HIF-1a并招募E3泛素连接酶复合物组件，在蛋白水解酶作用下泛素降解HIF-1a。羟基化促进HIF-1a多泛素化降解[7,8,9]。然而，在缺氧下，脯氨酸羟化酶活性减弱，羟基化被抑制，阻止pVHL蛋白与HIF-1a结合，导致HIF-1a累积，它入核与HIF-形成二聚物。异质二聚物HIF-1β与靶基因的启动子或增强子序列的缺氧反应元件(HREs)结合，诱导特定靶基因的活性。HIF的活性依赖于HIF-1a亚基的可用性，因此，为简单起见，我们用HIF-1a代替HIF分析其功能。
FIH1是天冬氨酸羟化酶，与PHDs相似，FIH1也是氧气依赖的羟基化事件，正常氧下，FIH1羟基化HIF-1a C端TAD 内的保守天冬氨酸残基(Asn803)，天冬氨酸羟化阻碍辅助因子p300/CBP的招募，因此，静息HIF-1a的转录活性。缺氧下，FIH1活性被抑制而解除了对HIF-1a转录活性的抑制。
1.3.2 P53的调控
在所有的细胞组织中，核苷酸还原酶(RNRs)合成四种脱氧核苷三磷酸盐(dNTPs)进行DNA复制和修复[10]。核苷酸还原酶功能依赖细胞的氧气。实验表明，在严重缺氧或绝氧下，核苷酸还原酶(RNRs) 活性下降使脱氧核苷三磷酸盐(dNTPs)水平降低，导致复制停止在复制叉处。复制蛋白A(RPA)覆盖到单链DNAs(ssDNA)上，充分招募ATR-ATRIP复合物，ATR-ATRIP与RPA-ssDNA结合，导致ATR-ATRIP复合物聚集使ATR的苏氨酸1989号位点磷酸化，ATR被激活，TopBP1作为ATR的脚手架，进一步促进ATR的完全活化。Hammond实验给出在严重缺氧下，由于复制阻断，ATR激酶信号通路被激活，p53丝氨酸15号位点被磷酸化，致使p53累积，因此，除了HIF-1a，肿瘤抑制因子p53是另一个重要的缺氧调控子。
研究表明在严重缺氧或绝氧下，p53累积诱导细胞凋亡。然而，研究者对缺氧诱导的p53调控凋亡的分子机制存在争议。p53响应缺氧应激活化，但是不能诱导传统的靶基因的表达，如p21、Bax，表明缺氧诱导的p53活化导致靶基因表达的模式不同于其它的应激，诸如辐射、紫外光(UV)照射及其它的DNA损伤。研究表明缺氧下，p53可以通过转录活化Puma、Fas/CD95基因，诱导细胞凋亡。
实验表明在不同的氧气浓度下，p53蛋白质的累积不同于HIF-1a蛋白质的累积。HIF-1a和p53两个转录因子作为缺氧下重要的调控子，它们之间是否存在直接的调控关系？文献给出缺氧应激下，HIF-1a和p53之间的调控随着氧气浓度的变化而变化[14]。中度缺氧下，HIF-1a下调p53的表达；严重缺氧下，HIF-1a上调p53的表达；绝氧下，p53抑制HIF-1a的表达。这样会出现氧气浓度变化导致模型不统一，为解决这一问题，我们提出HIF-1a和p53为活化，竞争有限的辅助因子p300，而后竞争Mdm2,被泛素化后在蛋白水解酶的作用下降解。这种双竞争机制可以解释HIF-1a和p53之间的相互关系。由p53同时行使转录激活和转录抑制功能，进一步解释氧气依赖的细胞命运抉择机制[10,11,15]。
2 研究模型
我们主要阐述缺氧应激下(氧气浓度不同)，HIF-1a和p53共同调控HCT116细胞系的应激响应。重点讨论HIF-1a和p53 信号通路及它们之间的关系。