模拟群体感应合作行为的基因回路的效果验证(5)
(2)LB固体培养基：称取40.0 GL7002-LB Broth-250G粉末，加蒸馏水至1000mL，121℃高压灭菌15min，冷却到合适温度加入相应抗性的抗生素后倒平板；
(3)TBK培养基：称取10g胰蛋白胨，7gKCl，20.93gMOPS，溶解于1L蒸馏水中，调节pH至5.72左右， 121℃高压灭菌15min；
(4)5*M9培养基:取6.4gNa2PO4•7H2O,1.5gKH2PO4,0.25gNaCl,0.5gNH4Cl,加入蒸馏水100ml,加热过滤调PH至7.4,121℃高压灭菌15min;
(5)1M MgSO4:取2.46gMgSO4溶解于10ml蒸馏水，加热过滤，121℃高压灭菌15min；
(6)1M Ca2Cl2:取2.191克Ca2Cl2•6H2O溶解于10ml蒸馏水，加热过滤，121℃高压灭菌15min；
(7)20%葡萄糖溶液：4g葡萄糖，20ml蒸馏水，121℃高压灭菌15min；
(8)20%乳糖溶液：4g乳糖，20ml蒸馏水，121℃高压灭菌15min；
(9)100mmol/L的IPTG溶液：称取0.238g IPTG粉末溶于10ml超纯水中，经过细菌过滤器分装到小EP管中保存待用；
(10)2%的X-Gal溶液：称取2g X-Gal粉末溶于100ml二甲基酰胺（DMF）中，配置成为20mg/L的X-GAL溶液，分装于玻璃管中，-20°保存；
(11)卡那霉素的配制：称取500mg卡那霉素粉末溶于10ml超纯水中，经过细菌过滤器分装到小EP管中保存待用；
(12)氨苄青霉素的配制：称取500mg氨苄青霉素粉末溶于10ml超纯水中，经过细菌过滤器分装到小EP管中保存待用。
2.2实验方法
2.21 菌种的扩大培养
取两支已灭菌的试管，分别加入5mL含相应抗生素的LB液体培养基，用移液枪挑取少量甘油保藏的菌种含pEGFP-C1+质粒的DH5α菌和TOP10F’菌，接种于LB液体培养基。在37℃，250rpm的恒温振荡培养箱中过夜培养。
2.22 提取质粒
本课题需要提取pEGFP-C1+质粒和pPopCtrl1质粒，具体步骤如下：
（1）取1-3ml 过夜培养的菌液，12000rpm离心1分钟，去尽上清液。
（2）加入200μL SolutionⅠ，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
（3）加入200μL SolutionⅡ，立即温和并充分地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的蛋清状溶液，此步骤不宜超过5min。
（4）加入350μL SolutionⅢ，温和并充分地上下翻转混合8-10次，室温放置2-5min。12,000rpm，离心10min。
（5）将步骤4中的上清液转移到2ml收集管内的GenClean Column中，室温6000rpm离心1 min，取出GenClean Column，倒掉收集管中废液。
（6）将GenClean Column重新放回收集管中，加入500μL SolutionⅣ，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。
（7）将GenClean Column重新放回收集管中，加入500μL Wash Solution，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。
（8）重复步骤7。
（9）倒掉收集管中废液，12000rpm，室温离心1min，彻底去除Wash Solution。
（10）将GenClean Column放入干净的1.5ml离心管中，向GenClean Column膜中央加入50-70μL Elution Buffer或超纯水，37℃放置2min，12,000rpm 室温离心1min，离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液，纯化好的DNA可立即用于后续实验或-20℃冻存备用。
2.23 琼脂糖凝胶电泳
对酶切反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，判断片段大小是否正确，同时为从胶中回收目的产物做准备。琼脂糖凝胶电泳具体步如下：
（1）用蒸馏水将电泳槽、制胶器和梳子冲洗干净、晾干，放在水平桌面上，在电泳槽中倒入稀释好的TAE电泳缓冲液。
（2）称量0.3g琼脂糖倒入干净的三角瓶中，量取30ml 1×TAE缓冲溶液加入三角瓶中，摇匀，在微波炉加热约45s，使瓶中的溶液沸腾持续约10s，取出三角瓶置室温冷却。
（3）待琼脂糖冷却至约50℃，用移液枪加入1μL EB，摇匀。
（4）将琼脂糖小心倒入制胶器，避免产生气泡，若有气泡轻轻用枪头赶出，迅速在一端插入梳子。