模拟群体感应合作行为的基因回路的效果验证(8)
9 先加IPTG,生长到17小时加入乳糖
10 乳糖，IPTG
11 乳糖，IPTG
12 乳糖，IPTG
分别在6.0h，7.5h，9.5h，11.5h，13.5h，15.5h，17.0h，19.0h，21.0h，23.0h，25.0h，26.5h，27.0h，28.5h的时间点从试管中取菌液200uL加入96孔板中，利用酶标仪在600nm可见光波长下测定OD600，画出OD600随时间变化的曲线即为工程菌在TBK培养基中好氧条件下的生长曲线。
在无氧、TBK条件下，以OD600 为纵轴，以培养时间为横坐标的生长曲线的绘制。首先将8个克隆分别接种于含卡那霉素的LB培养基中过夜培养，按1.0%的接种量接种于200μL含卡那霉素TBK培养基中，用50μL石蜡油液封，，具体设置方法见表2.8：
表2.8无氧、TBK条件下生长曲线测定方案
编号 碳源与诱导剂—:空白对照 L:乳糖 I:IPTG
放入酶标仪中自动检测，酶标仪的具体参数设置如表2.9：
表2.9厌氧培养时酶标仪的设置参数
参数 参数值
板类型 96 WELL PLATE
设置温度 设置点 30°C
移至下一步骤前先预热
振板 线性: 0:20 (MM:SS)
频率: 567 cpm (3 mm)
开始动力学 运行时间 48:00:00 (HH:MM:SS), 时间间隔 0:10:00, 289检测
检测 吸收光终点
全板
波长: 600
检测速度: 正常, 延迟: 100 msec, 测量值/数据点: 8
结束动力学
画出OD600随时间T/min变化的曲线即为工程菌在TBK培养基中厌氧条件下的生长曲线。
在无氧、TBK条件下，以OD600 为纵轴，以培养时间为横坐标的生长曲线的绘制。首先将克隆体接种于含卡那霉素的LB培养基中过夜培养，按1.0%的接种量接种于200μL含卡那霉素TBK培养基中，用50μL石蜡油液封，，具体设置方法见表2.10:
表2.10无氧、M9条件下生长曲线测定方案
编号 培养基G:葡萄糖 L:乳糖 I:IPTG
放入酶标仪中自动检测，酶标仪参数设置与表2.7相同，画出生长曲线。
2.30工程菌性状的稳定性与IPTG的诱导性
取转化一个月后工程菌，验证工程菌对乳糖，IPTG的表现性状，测试IPTG诱导能力，具体设置方案如表2.11：
表2.11工程菌的性状稳定性与IPTG诱导性验证方案
编号 LB培养基成分 培养时间 菌落颜色 颜色变化顺序
A 葡萄糖 X-gal
24~48小时
B 乳糖，X-gal
C 乳糖，葡萄糖，X-gal
D 乳糖，IPTG, X-gal
E 乳糖，葡萄糖，IPTG,X-gal
3. 实验方案、结果与分析
3.1实验方案
含有目的质粒的大肠杆菌Top10F在含有乳糖的培养基中生长，产生AHL，并且在IPTG的诱导下表达LuxR蛋白和LuxI蛋白。当培养基中AHL浓度达到一定值时就会激活LuxR产生LuxR*，LuxR*会启动质粒中的LacZα基因表达，产生β-半乳糖苷酶的α肽，与细菌基因组编码的β-半乳糖苷酶C端产生互补，组成有活性的β-半乳糖苷酶。这样就使得细菌能够利用培养基中的乳糖继续生长。以上就是目的质粒产生作用的分子生物学过程。在宏观上就是在细菌的种群的密度达到一个阈值后，原来不能利用乳糖的细菌开始可以利用乳糖。