重组β-内酰胺酶基因诱导表达及蛋白质的分离纯化研究(2)
2.3.2 VIM-1 洗脱液BCA法测蛋白含量 12
2.3.3 VIM-1 SDS-PAGE电泳 12
3 讨论 13
致谢 13
参考文献 14
引言
细菌耐药性的出现是现在抗感染领域十分严峻的重大挑战[1]，尤其是在我国滥用抗生素的情况下[2]，细菌耐药性呈现扩大的趋势。李秀银等学者将抗生素分为16大类：青霉素（(1) 青霉素类 ( 2) 青霉素复合制剂 ( 3) 青霉素+ 酶抑制剂)、 第1 代头孢菌素、第2 代头孢菌素、第3 代头孢菌素、第4 代头孢菌素、头孢菌素+ 酶抑制剂、巯青霉素烯类、氨基糖苷类、 四环素类、 酰胺醇类、大环内酯类、 糖肽类、磺胺类、喹诺酮类、硝咪唑类、其他抗生素类等[3]。其中青霉素、头孢菌素等含有典型β-内酰胺环的抗生素被统称为β-内酰胺类抗生素，该类抗生素能够抑制细菌细胞壁的合成，具有广谱性、抗菌能力强、疗效好、致敏性低、不良反应小等特点，是目前应用最广、实用性最强的一类抗生素[4]。细菌对该类抗生素的耐药机制主要是产生β-内酰胺酶。
β-内酰胺酶(Beta-lactamases，BLA)，是一类由细菌产生的能够降解β-内酰胺类抗生素从而使其抗菌作用减弱或消失的酶[5]。根据Ambler分类法可将β-内酰胺酶分为A、B、C和D四类[6-8]。A,C, D三类的活性位点处的丝氨酸可用来水解β-类酰胺类抗生素，统称丝氨酸酶；B类通常需要金属锌离子等来催化进而水解β-类酰胺类抗生素，也称为金属酶(MBL)，这类酶通常能被整合剂EDTA(即乙二胺四乙酸)所抑制[9]。A类酶一般优先水解青酶素类抗生素，分子量约为29.0 kD；C类酶则对头孢菌素类的水解活性较大，分子量大概在39 kD左右,氨基酸序列与A类酶之间没有明显的同源性；D类酶则偏向作用于苯唑西林及类似物等药物，分子量约为30.0 kD；B类酶的分子量约为23.0 kD，活性部位有1-2个金属离子，可以水解抗菌能力较强的抗生素比如碳青霉烯类等。本实验诱导表达的三种临床危害严重的β-内酰胺酶重组基因CTX-M-15、OXA-45（oxacillin-hydrolyzin-45）以及VIM-1分别属于A类酶、有丝氨酸活性位点的Ｄ类酶、B类酶[10-13]。
为消除或减弱β-内酰胺酶的耐药性质，β-内酰胺酶抑制剂应运而出。β-内酰胺酶抑制剂能够抑制该类酶的活性从而恢复或增强β-内酰胺类抗生素的作用。1976年，英国从链霉菌中发现第一个β-内酰胺酶抑制剂克拉文酸，其能抑制部分广谱和超广谱β-内酰胺酶，常与阿莫西林联合应用，可使阿莫西林对某些细菌的最低抑菌浓度（MIC）值降低[14]。目前，寻找新型β-内酰胺酶抑制剂已成为研究的热点。
本实验通过对含有上述三种β-内酰胺酶的重组质粒（pET28a::CTX-M-15、pET28a::OXA-45、pET28a::VIM-1）的大肠埃希氏菌Escherichia coli进行诱导表达，通过亲和层析方法获得相应的高纯度的β-内酰胺酶蛋白，最后通过SDS-PAGE电泳检测其纯度。这是进行新型β-内酰胺酶抑制剂的高通量生化筛选的首要步骤，并为其提供药靶蛋白。