重组大肠杆菌表达的肠激酶的纯化工艺优化研究(2)
1.2.5包涵体的复性 3
1.2.6包涵体的浓缩 3
1.2.7酶切 3
1.2.8GenericMC-SP阳离子交换柱分离纯化 3
1.2.9SDS-PAGE电泳 4
1.2.10蛋白质浓度测定 4
2结果与分析 4
2.1重组大肠杆菌发酵结果分析 4
2.2重组大肠杆菌破碎结果分析 4
2.3包涵体变性结果分析 4
2.4变性液超滤结果分析 4
2.5包涵体复性结果分析 4
2.6复性液浓缩结果分析 5
2.7酶切前后电泳分析 5
2.8 GenericMC-SP阳离子交换柱的纯化结果及buffer优化分析 5
2.9 SDS-PAGE电泳分析 7
2.10蛋白质浓度测定结果分析 9
3讨论 9
4致谢 10
参考文献 10
引言
肠激酶(EK)是哺乳动物肠道内的一种丝氨酸蛋白水解酶，分子质量为150 kDa，由一条115 kDa的重链和一条35 kDa的轻链组成, 两条链通过一对二硫键相连。重链把轻链锚定到消化道的细胞膜上，它对相对分子质量大的蛋白的识别起着辅助作用，但对相对分子质量小的多肽的识别影响较小,轻链则具有催化活性，在pH值为4.5-9.5,温度为4-45 ℃的区间内能够特异性地识别胰蛋白酶原中Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下[3],将胰蛋白酶原转变成胰蛋白酶，进而启动多种酶原活化的级联反应，因而肠激酶可作为蛋白表达体系中融合蛋白的切割试剂。而重组肠激酶（rEK）的分子质量普遍为26.3 kDa，包含三个糖基化位点，它的糖基化分子质量大约为43 kDa，rEK体外实验证明有全酶酶切特异性并且相比于天然肠激酶表现出对基因工程融合蛋白底物的酶切活性增强[4]，因而现在多采用基因工程的方法生产重组肠激酶。
迄今为止,EK已经分别从猪、牛和人等的肠道组织中纯化得到[5]，但天然肠激酶来源有限，并且从这些动物组织中提取的肠激酶容易受到其它蛋白酶的污染，这给实际应用带来了困难，所以国内外一直都有通过重组大肠杆菌的表达研究来生产重组肠激酶的项目，但大部分都表现出产量低，无法大规模生产的缺点，而且近年来，国外相关实验对重组肠激酶所做的尝试多是表达235个氨基酸的轻链[6]，并没有其它创新型的方法。尽管已经有对重组肠激酶的大量研究，但是对于目前广泛应用的大肠杆菌表达系统获得的肠激酶轻链包涵体产物，仍然存在着包涵体产物复性困难，蛋白活性低的问题，而且，随着生物技术的发展，仍需要表达量高，活性好且适用于生产的重组肠激酶。
目前市场上1000 u/ml包装的肠激酶大约要卖1万元左右[7]，价格非常昂贵，而且纯度高的肠激酶尤其适用于生物制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究，可见若采用最优化生产肠激酶替代市场购买将会给企业带来很大的利益。
本研究利用万邦医药生物制品车间发酵实验室获得的重组大肠杆菌的表达来制备肠激酶粗酶液，具体方法是先通过破菌得到包涵体水溶液，再利用包涵体变性复性使目的蛋白纯度增加，接着加入买来的肠激酶酶切过夜，后调酸沉淀使大量的硫氧还蛋白沉淀下来，过滤得到上清最后纯化分析得到重组肠激酶的粗酶液，用于生物制品车间的生产使用；另外，本次研究也通过改变变复性条件、层析柱的类型、buffer的类型等多项数据而得出生产肠激酶的最优条件和方法。
1材料与方法
1.1供试材料
1.1.1质粒和菌株