糖基化处理对大豆分离蛋白功能的影响(2)
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验试剂：盐酸、邻苯二甲醛(OPA)、SDS、2-巯基乙醇、硼砂。
1.1.2试验样品：葡萄糖、大豆分离蛋白、金龙油。
1.1.3溶液配制：
大豆分离蛋白和糖基化大豆分离蛋白的溶液配制：
将葡萄糖与大豆分离蛋白按质量比1:4溶解在蒸馏水中配制成蛋白质质量浓度为0.02 g/mL的混合液。
将葡萄糖与大豆分离蛋白按质量比1:4溶解在蒸馏水中配制成蛋白质质量浓度为0.01 g/mL的混合液。
称取10 g大豆分离蛋白溶解在蒸馏水中配制成蛋白质质量浓度为0.02 g/mL的混合液。
将上述混合液放在恒温振荡器中，温度调节为60 ℃，条件下反应5 h，得到糖基化产物。
经过不同的条件改变，分析大豆分离蛋白和糖基化产物在溶解性、乳化性和凝胶性质上的差异，研究糖基化对大豆分离蛋白功能性质的影响。
1.1.4主要仪器
表1 主要仪器一览表
Table1 main instruments list
仪器名称 生产厂家
E-201-9 PH计 上海佑科仪器仪表有限公司
THZ-98AB恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司
BCD-215-KCM冰箱 青岛海尔股份有限公司
JJ-2组织捣碎机 常州华冠仪器制造有限公司
723可见分光光度计 上海元析仪器有限公司
HWS24电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司
AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司
HH-S型水浴锅 巩义市英峪予华仪器厂
1.2试验方法
1.2.1 调节PH定性分析溶解性
试验过程：将上述0.02 g/mL大豆分离蛋白、0.02 g/mL糖基化大豆分离蛋白0.01 g/mL糖基化大豆分离蛋白3种样品分别取10 mL与烧杯中，同样也将试验前配制好的1.6 mol/L盐酸溶液取10 mL倒入小烧杯盐酸溶液，然后用胶头滴管按照试验要求进行滴加试验。
1.2.2 响应面试验分析凝胶强度
采用中心组合设计进行试验，通过反应温度、反应时间、糖的添加量三种因素三水平进行响应面的分析。
表2 响应面试验设计因素水平表
Table2 Factors and levels of response surface methodology
水平 因素
A 反应温度/℃ B 反应时间/min C 糖的添加量/％
-1 60 30 5
0 70 45 10
+1 80 60 15
按照软件设计的试验方案，进行试验研究，并从1-17号进行标记。
对于利用糖基化处理来改变大豆分离蛋白凝胶性的强度分析，采用OPA比色法，即是邻苯二甲醛比色法[6]。
OPA试剂的配制：先准确称取邻苯二甲醛50 mg，然后将其溶解在1 mL的甲醛溶液中，然后再加入5 mL质量分数为10％的SDS和100 uL的2-巯基乙醇和25 mL的0.1 mol/L的硼砂，充分混均，最后将其定容至100 mL，现配现用。
过程：用移液管量取OPA试剂5 mL置于试管中，然后用移液枪取200 μL的样品液（10 mg/mL），充分混均后，在35 ℃水浴反应3 min，并对OPA试剂中加入200 uL的蒸馏水为试验对照，测量340 nm处吸光度。
公式：DG％=(A1-A2)/A1×100
其中A1和A2分别为t时刻样品溶液和试验对照样品溶液的吸光度
1.2.3 利用比色法来测定乳化程度
参照Pearce和Kinsella的方法，进行改进[7]。将提前配制好的0.01 g/mL大豆分离蛋白溶液和0.01 g/mL的糖基化大豆分离蛋白溶液，用量筒各自量取25 mL，然后用100 mL的容量瓶定容，得到5 mg/mL的溶液，接着按金龙油：待测液=1：3添加66 mL待测液、22 mL金龙油，倒入高速匀浆机中，在旋转速度为10000 r/min的下搅拌，1 min后用移液枪取出200 uL，用质量分数为0.1%的SDS稀释到10 mL，用质量分数为0.1%的SDS作为试验对照，500 nm下测吸光值，即为乳化值（EA）记做A，10 min后仍然使用相同的方法取出200 uL，用0.1%的SDS稀释到10 mL，用0.1%的SDS作为试验对照，500 nm下测吸光值记做B。