森林草莓组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶基因的鉴定和分析(2)
1 材料与方法
1．1 数据来源 森林草莓（Fragaria vesca）和中国莲（Nelumbo nucifera）的数据来源于 NCBI，苹果(Malus domestica)、桃（Prunus persica）、黄瓜（Cucumis sativus）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）和番茄（Solanum lycopersicum）数据来源于 Phytozome (version 10.3; http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。
1．2 HAT、HDAC 基因的鉴定与保守序列分析 从 Pfam 网站分别下载 GNAT、CBP、MYST、TAFII250、RPD3/HDA1 和 SIR2 家族关键结构域序列（Acetyltransf_1 domain，PF00583；MOZ_SAS domain，PF01853；Acetyltransf_7 domain， PF13508； Hist_deacety domain， PF00850； SIR2 domain， PF02146），家族HDAC 基因，通过 MEME网站分析得到拟南芥中所有 HD2 基因蛋白的保守序列，并构建HMM文件，然后利用HMMER软件搜索所选物种中HD2基因。将所有候选HD2基因提交MEME网站进行 motif分析，保留与拟南芥 HD2蛋白motif相似的序列，得到所有的 HD2 基因。将得到的所有候选基因提交 Pfam[12]、CDD[13]网站，保留其中包含HAT、HDAC 基因关键结构域或保守序列的基因，并得到 HAT、HDAC 基因中包含的其他保守结构域，其中设置 e 值<=10-4。数据处理中，保留同一基因不同可变剪切中最长的氨基酸序列。
1．3 多序列比对和系统进化树构建 对GNAT、CBP、MYST、TAFII250、RPD3/HDA1 基因家族运用 MAFFT（V7.158b）软件对全蛋白序列进行比对，得到的比对文件运用 Raxml (Version 8.1.16)软件构建系统发生进化树。参数设置为：MAFFT比对设置为默认参数，Raxml 设置为γ 分布和1 000次Bootstrap 重复；SIR2 家族和HD2家族蛋白序列，运用 MEGA 5.0 进行序列比对，并用邻近法Neighbor-joining构建进化树，Bootstrap 设置为1 000。
1．4 基因染色体定位与基因复制类型分析 从森林草莓基因组注释信息提取 HDAC 基因相关染色体位置信息，运用 MapInspect软件构建基因染色体定位图；运用 McscanX 软件[14]对HDAC 基因进行复制类型分析，McscanX参数设置为默认参数。
1．5 森林草莓中 HAT 基因和HDAC 基因的表达分析 根 据 森 林 草 莓 中 HDAC 基 因 的 基 因 ID 从 SGR（http://bioinformatics.towson.edu/strawberry/Default.aspx）网站下载相应基因的表达数据。数据处理过程为：计算生物学重复平均值，并取值 log2，运用 Mev9（Version 4.9.0）软件将数据可视化。
1．6 材料处理 将所有生长于 MS 培养基上的30 d大小的二倍体森林草莓苗（‘Rugen F7-4’）避光开盖24 h 后，分别进行冷胁迫处理和热胁迫处理。其中，低温胁迫处理：在避光、4℃低温条件下分别处理 0、1和8 h。高温胁迫处理方法：在避光、38℃高温条件下分别处理0、1和 3 h，并在热处理3h结束后分别进行 1 h（共4 h）恢复和 5 h（共8 h）恢复处理。