调控荷花重瓣化候选基因的发掘及其表达分析(2)
然而，上述花器官发育以及重瓣花形成的分子机理仅限于模式植物，目前关于荷花花型方面的研究，大多是花器官组织发育特征的形态学观察及染色体组型分析等，对于荷花重瓣化的分子机理知之甚少。本试验将以重瓣荷花复合芽为材料，取花芽分化前和花芽分化中两个时期的花芽构建两个转录组文库，通过高通量测序，获得花芽分化前和分化中的转录组，通过分析差异表达的基因，从而发掘调控荷花重瓣化的关键基因并分析其表达特征。1 材料与方法1.1 供试材料试验材料为重瓣型荷花品种‘春雨’以及单瓣型荷花品种‘H6-2’，由南京艺莲苑水生花卉公司提供。于 2016 年 5月上旬，将供试品种的种藕种植于 460*310mm 的塑料花盆中，土层厚约 20cm，水层约 3-5cm，每盆一株，单瓣品种种植 50 盆，重瓣品种种植 250 盆，正常肥水管理。
1.2 取样2016 年 6 月-8 月之间对处于花芽分化前的芽体及花芽分化中的花芽、叶芽分别采样，液氮冷冻，-80℃保存。分别提取两个不同时期的花芽总 RNA。荷花的顶芽是复合芽，花芽分化前的芽体是没有花芽的腋芽或顶芽，其中包含叶芽及未分化的花芽组织；花芽分化中的芽体是花芽及伴生叶芽。
1.3 总 RNA提取方法
1.3.1 物品的处理去除枪头及离心管的 RNase：将枪头及离心管放入 1‰ DEPC 水中。室温放置一昼夜后，连水一起高压灭菌，弃水后烘干即可。玻璃器皿可在 180℃烘烤 3 h 以上。1.3.2 试剂CTAB裂解液：100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20 mmol/L EDTA-Na2，2 mol/L NaCl，2% CTAB(w/v)，1% pvp（聚乙烯吡咯烷酮）(w/v)。β-巯基乙醇，氯仿，异戊醇，无水乙醇，异丙醇1.3.3 RNA提取步骤（1）水浴锅调至 65℃。（2）在 2 ml 离心管中加入 1 ml CTAB裂解液，再加 30 µl β-巯基乙醇混匀，于 65℃水浴锅中预热。（3）取约 200 mg 样品加液氮研磨，迅速加入离心管，混合均匀后放入预热的水浴锅中，水浴 10 min，其间隔60 s颠倒混匀。