基于环化剪接的植物基因簇克隆与重构(3)
1.3 基因簇克隆方法 天然产物异源表达的前ᨀ是获得编码基因，基因簇原位克隆是保证基因高保真性的关键。研究发现许多植物中相关功能的基因成簇存在[23]，植物次生代谢产物通常由大片段的基因簇编码而成。目前已应用于大片段基因簇克隆的方法有基因组文库构建、RecE蛋白介导的同源同组[24]，以及转化介导的重组克隆（Transformation-associated recombination cloning, TAR克隆）[25]等。基因组文库随机捕获基因组序列，工作量大，筛选麻烦；RecE介导的同源同组克隆要求目的基因簇两端有合适的酶切位点，且克隆长度较短（无法克隆40 kb以上的DNA片段）；TAR克隆利用酵母的高效同源重组系统捕获大片段基因簇，Yamanaka等用TAR克隆技术直接从链霉菌Saccharomonospora sp. CNQ-490 基因组中克隆了67-kb的taromycin基因簇，然而该方法效率较低。以上克隆策略由于克隆长度有限，难以满足上万碱基对的植物基因簇的克隆，如Noscapine基因簇长达104 kb，因此需要开发新的克隆技术以克服DNA转化过程对大片段的内化限制。为此，本研究建立了新型的大片段植物基因簇克隆方法，环化剪接(excisions by cyclization， EXCY)克隆， EXCY克隆将CRISPR/Cas9染色体编辑技术与FLP/FRT重组系统相结合以发挥功能。
1.4 CRISPR/Cas9染色体编辑技术 CRISPR/Cas9 是微生物用于抵御外源 DNA 入侵的核酸酶系统，大约 40%的细菌和 90%的古细菌拥有这种适应性免疫防御系统。该系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 guide RNA 来指导同源序列的降解，从而ᨀ供免疫性，CRISPR/Cas9 介导的基因组定点编辑技术是基于细菌这种适应性免疫防御系统改造而成[26]。来源于酿脓链球菌的 Cas9 核酸内切酶与相应的介导 RNA 配合靶向指导 5′-N20-NGG-3′ （N 代表任意碱基）序列的切割，其中N20序列与介导RNA 5′ 端的 20 个碱基序列（作为介导RNA的间隔序列）相同，NGG 称为原型间隔序列毗邻基序（PAM 位点）[27]。其作用机理如图 1.2所示。
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