亚硝酸盐还原酶基因工程菌的构建(2)
2.2.8重组质粒的提取.....13
2.2.9 PCR鉴定.....14
2.2.10 E.coli TG1感受态细胞的制备.....14
2.2.11重组质粒转化大肠杆菌TG1表达菌株及鉴定...14
2.2.12重组质粒在大肠杆菌中的表达...14
2.2.13蛋白凝胶电泳分析...15
2.2.14 BCA法蛋白定量..15
2.2.15表达后各重组蛋白的酶活测定...15
2.3 结果与分析 .15
2.3.1 PCR扩增目的片段.15
2.3.2重组质粒的双酶切与PCR鉴定.16
2.3.3重组蛋白的诱导表达 ...17
2.3.4 不同的蛋白样品浓度测定及酶活测定结果17
2.4 讨论...17
3结论与展望 .19
3.1 结论 .19
3.2 展望 .19
致谢 20
参考文献 21
1绪论
1．1亚硝酸盐还原酶简介
亚硝酸还原酶（nitrite reductase）是还原亚硝酸盐的酶，同化硝酸盐的同化型亚硝酸还原酶含siroheme，进行6个电子的还原产生氨。高等植物、绿藻及蓝藻的酶以铁氧还原蛋白为电子供体。高等植物只存在于叶绿体或前质体中。菠菜叶的酶分子量6万，含siroheme、非血红素铁及对酸不稳定的硫。亚硝酸还原酶为单条肽链，分子质量63kDa。其辅基包括一个血红素和一个4Fe-4S簇。亚硝酸还原酶的催化反应以铁氧还蛋白为电子供体，6个电子依次由亚硝酸还原酶的4Fe-4S簇和血红素被转移到底物亚硝酸，使后者被还原为铵离子。
亚硝酸盐还原酶是一种可还原亚硝酸盐生成氨的酶[1]。目前，国内外研究者们已经从豌豆叶片、大麦根、多类细菌中分离提纯到NIRs，并对其酶学性质和蛋白结构做了较为深入的研究。一些国外学者己开始从分子水平研究NIRs的基因结构、调控和转录表达等[2~4]。
NIRs作为一种胞内酶，在高等植物、藻类植物和许多微生物中广泛存在。在植物细胞中NIRS位于叶片的叶绿体中和非绿色组织中的质体中[5];在微生物细胞中有的游离在细胞质中，有的整合在细胞膜上[6,7]。
根据辅基的不同，目前普遍认为NIRS分为两类:血红素cdl型亚硝酸还原酶(edl一iRs)和铜型亚硝酸还原酶(Cu一iRs)。Edl一NIRs呈二聚体结构，是还原亚硝酸盐最常见的酶，此酶还具有细胞色素氧化酶的作用;Cu一iRs呈三聚体构，每个单体都含有两种类型的铜原子[8~10]。
NIRS表达活性需要电子供体，根据其电子供体的不同，NIRS又可分为双叶琳环型NIRS;优尔叶琳环型NIRS;FAD依赖性金属蛋白酶;甲酸盐依赖性NIRsNAD(p)H依赖性NIRs和铁氧还蛋白依赖性NIRS等优尔类[8,11]。
乳酸菌是人体健康的益生菌，有促进营养的分解与吸收，抑制肠道有害菌生长，调节肠道正常微生物菌群平衡，降血压，降胆固醇，抗肿瘤等保健功能，在
功能性食品及传统食品加工中有着广泛应用。乳酸菌在发酵过程中还可产生一些特殊酶系[12，13]，例如亚硝酸盐还原酶，它能够催化亚硝酸盐还原。食品中若亚硝酸盐残留超标，可存在致癌的危害。当前，由于含氮化肥的大量使用以及工业废水的不合理排放与灌溉，致使蔬菜中亚硝酸盐残留量较高。近年来，越来越多的研究者开始关注利用乳酸菌控制食品中亚硝酸盐残留问题。张庆芳等[14，15]对
乳酸菌降解亚硝酸盐机理的研究认为乳酸菌发酵产生的乳酸及亚硝酸还原酶都能起着降解亚硝酸盐的作用。夏岩石等[16]比较了自然发酵与乳酸菌接种发酵豆角过程中降解亚硝酸盐的动态，分析了不同发酵度和起始pH条件下发酵液亚硝酸盐含量的变化。周光燕等[17]研究了乳酸菌对泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量变化的影响。研究结果均显示，乳酸菌具有显著降解亚硝酸盐的功能。
迄今为止，人类共发现了4种类型的亚硝酸盐还原酶：nrfA、nasB 、nirK、nirS[18]。不同类型的亚硝酸盐还原酶在基因和蛋白序列方面存在差异，即使同种类型的亚硝酸盐还原酶，存在于不同种类微生物中时，其序列也会表现出明显不同[19]。1.2 亚硝酸盐的危害及来源
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