IL-6R是由468个氨基酸组成的,有6个N糖基化位点。IL6R分为细胞膜结合型和可溶性IL6R(human soluble IL6R,hhsIL6R)两种类型。IL6R主要分布在淋巴细胞和非淋巴细胞,如活化B细胞,骨髓瘤细胞,静止T细胞、肝细胞和单核细胞等。单独IL-6R与IL-6结合的亲和能力较低。IL-6发挥其重要的生物学活性,是通过与其受体结合然后诱导一系列的胞内信号传导。由于IL-6在许多疾病中发挥重要作用,因此通过对IL6R在疾病组织中的表达情况的检测,可以对相关疾病的情况进行评价或跟踪。

本实验采用以人重组IL6R为免疫原,分别免疫小鼠及兔,采用杂交瘤技术制备抗IL6R鼠单抗,通过纯化兔血清制备抗IL6R兔多抗;将重组蛋白IL6R进行生物素化标记,通过阻断抑制其与重组IL6的结合测定抗体的中和活性;利用单抗和多抗建立ELISA双抗夹心法定量或定性检测样本中IL6R水平的方法,来制备高灵敏度的抗人白介素6受体(IL6R)鼠单克隆抗体及兔多克隆抗体,并进行鉴定,同时筛选具有中和活性的鼠单克隆抗体;通过多抗和单抗配对,制备高灵敏度的人IL6R酶联免疫检测试剂盒。本实验以高亲和力和高纯度的抗体为基础,筛选具有中和活性的抗体,同时选用具有生物活性的重组人IL6R为检测标准品,建立了检测天然IL6R的ELISA方法,该方法方便易行,检测灵敏度和准确度高、特异性强、能够同时快速检测大批样本,成本低,可靠性强,预计将在IL6R相关基础和临床研究中发挥重要作用。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物、细胞及重组蛋白

SPF级Balb/c小鼠,雌性,6-8周龄,由北京维通利华实验动物中心提供;新西兰大白兔,清洁级,体重2.2kg以上,由北京维通利华实验动物中心提供;小鼠骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存;重组人IL6R、IL6均由本公司制备。

1.1.2主要试剂

RMPI1640培养基、胎牛血清购自GIBCO公司;弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)、HAT、聚乙二醇(PEG)、生物素(Biotin)、优尔根过氧化物酶标记的链亲和素购自VECTOR,抗体亚型鉴定试剂盒均购自Sigma公司。

1.2实验方法

1.2.1人IL6R蛋白小鼠单克隆抗体的制备

1.2.1.1动物免疫。采用Balb/c小鼠作为免疫动物,以具有生物活性的重组人IL6R蛋白为免疫原,免疫剂量为50µg/只,首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂充分乳化,腹部皮下多点注射,间隔2周取相同剂量免疫原与等体积不完全弗氏佐剂制成乳化剂,加强免疫两次。取血清效价高的小鼠腹腔加强免疫一次,4天后取脾细胞进行融合。

1.2.1.2细胞融合和克隆化。取免疫小鼠脾细胞,按5:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞混合,利用聚乙二醇法进行融合,获得杂交瘤细胞。采用重组人IL6R蛋白作为包被抗原,用ELISA法测定细胞上清液,选取阳性孔通过有限稀释进行克隆化,直至得到稳定分泌抗IL6R特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株A001和A002。

1.2.1.3单克隆抗体的生产与纯化。选取筛选阳性杂交瘤细胞株,利用培养瓶进行细胞培养,收集细胞培养上清,利用蛋白A进行亲和纯化,分装后于-20℃低温保存。

1.2.2人IL6R蛋白兔多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物,以重组人IL6R蛋白为免疫原,免疫剂量为500µg/只,首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂制成乳化剂,颈背部皮下多点注射,此后每间隔2周取相同剂量免疫原与等量不完全弗氏佐剂制成乳化剂,

加强免疫四次,测定血清效价,心脏取血,经蛋白A和IL6R蛋白抗原亲和纯化

后得到纯化的多克隆抗体。

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