木质素降解菌株烟草节杆菌CK的分离与鉴定(2)
1. 材料与方法
1.1 实验试剂与仪器 高压蒸汽灭菌锅；摇床；离心机；PCR 仪；冰箱；恒温培养箱；显微镜；源!自`优尔'文"论/文`网[www.youerw.com凝胶成像仪；无菌操作台；琼脂糖；上海生工 PCR 扩增试剂盒；API 20NE标准比色卡（含附加试剂）；路哥尔氏碘液；草酸铵结晶紫染液；95%乙醇；番红染液；EB染液；Loading buffer×10；marker；香柏油；50X TAE Buffer。
1.2 样品来源与培养基 从中国东海海域海水进行取样，整个过程都用灭过菌的仪器进行操作（包括广口瓶和吸管）。 海水培养基： Solution A: 22.7g NaCl ,3.98g Na2SO4 ， 0.72g KCl ， 0.27g NH4Cl，47.2mg Na2HPO4 ，83mg NaBr ，31mg NaHCO3，27mg H3BO4，2.6mg NaF，1.3g TAPSO，890mL H2O。pH7.6 高压灭菌。 SolutionB:11.18g MgCl2▪6H2O，1.46g CaCl2▪2H2O，24mg SrCl4▪6H2O，100mL H2O.高压灭菌。 SolutionC: 0.02g FeCl4▪6H2O，100mL H2O。过滤灭菌。 按 890毫升 SolutionA，100毫升 SolutionB，10毫升 SolutionC 的比例混合配制成海水液体无机培养基，需要时加入 0.1％香草酸。向其中添加 2g/L胰蛋白胨和 1g/L 酵母提取物混匀，高压灭菌则为海水营养培养基。（注：SolutionC 不可高压灭菌，在无菌操作下加入即可） 富集培养基：碱木质素 1g，海水液体培养基，固体培养基添加 20％琼脂。 木质素无机盐培养基（选择培养基） ：液体培养基在富集培养基的基础上增 2g碱木质素。固体培养基加相应的琼脂即可。 1.3 菌的分离培养 取采集样品 1mL于Eppendoff离心管中；加入无菌水对原液进行梯度稀释，将样本稀释成多个浓度梯度，再将不同浓度梯度的菌液各取 1mL 于海水营养固体培养基一天，观察菌落生成情况并筛选单菌落。培养条件是将平板置于 30℃的培养箱中。稀释的浓度梯度如下： 序号 1 2 3 4 5 稀释梯度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 1.4 菌株的富集与纯化筛选 挑取单菌落与木质素作为唯一碳源的富集培养基中，静置于 30℃的生化培养箱中培养。间隔 24 小时观察菌落生长情况并作相应记录，筛选出能降解木质素的菌种。 待富集培养基长出菌落后即可挑取菌落与木质素无机盐培养基中进行纯化培养直至只有单菌落为止。
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