AFLP分子标记研究内生真菌EGZ0807突变株基因(2)
随着紫杉醇产生菌——安德氏紫杉霉(Taxomyces andreanae)被美国科学家Stierle 等从短叶红豆衫的韧皮部分离得到，掀起了对植物内生真菌及其活性物质开发的热潮。研究热点主要集中在新的抗肿瘤，抗生素类等活性化合物的发现，此外还研究得到了植物生长调节，抗氧化及一些其它的活性物质，植物内生真菌已成为发现新天然活性物质的重要资源。
药用植物内生真菌能够产生多种抑制病毒，病原体，细菌及真菌等的抗生素。Strobe G [4]等由雷公藤Tripterigeum wilfordii 的茎中分离出一株内生真菌，它能够产Cryptocandin，它既可以抑制菌核病菌及灰葡萄孢等致病真菌，也可以抑制白假丝酵母及人类病原真菌Trichophyton sp.。戴文君[5]等采用了抗菌及抗肿瘤活性实验对72株海南粗榧内生真菌筛选。实验表明，其中的9株至少对一种指示瘤株拥有细胞毒性，有5株能很好的抑制金黄色葡萄球菌，还有l株能抑制优尔椒疫霉的生长。
1.2 空间诱变的应用现状及其发展前景
从自然界直接分离到的野生型菌株积累产物的能力往往较低，无法满足工业生产的需要，这就要求对它们进行菌种改造，即育种。育种的手段很多，从微生物育种发展的历史看，有定向培育，诱变育种，杂交育种和基因工程等育种技术。当前发酵工业和其他生产单位所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外，还可达到改善产品质量，扩大品种和简化生产工艺等目的。研究和实践证明，空间诱变具有变异幅度大，有益变异多，有利于加速育种进程和改进品质等特点，并有希望从中获得传统育种方法较难获得的，对产量和品质等重要经济性状产生重大影响的罕见种质材料，成为培育突破性品种的有效途径之一。但是目前通过利用航天器进行的空间实验受到其技术要求高，成本高，实验机会有限等条件制约，无法大量投入生产。因此，地面模拟空间环境因素的试验研究对于开展作物诱变改良具有非常重要的实际意义。
空间诱变[7,8]是一种新型有效的微生物育种手段,是将航天高技术与传统的物理化学诱变及分子技术等相结合的综合的新的育种技术。利用卫星或高空气球携带，搭载微生物等生物体样品，经特殊的空间环境条件（强宇宙射线，高真空，微重力等）作用，引起生物体的染色体畸变，进而导致生物体遗传变异[9,10]，经地面选育试验后，能快速而有效地育成生物的新品种（系），供生产和研究使用。
随着人类对空间资源的开发利用和世界航天工业的发展，有关空间环境对生物体的效应研究已很受重视，并取得了不少科研成果。我国返回式科学实验卫星的发射成功，使我国对空间资源的开发利用成为可能并具备了条件，空间诱变育种研究亦随之兴起。近年空间诱变的研究[11,12]进展迅速，已涉及到形态学，细胞学，生理生化，分子生物学等领域，并开始进行地面模拟失重实验，目前众多科研工作者以各种种植资源为研究对象进行空间诱变作了大量的工作。
1.3 AFLP分子标记概述
PCR技术的出现是DNA遗传分析的一场革命，以PCR为基础的DNA指纹技术大大加快了人类研究生物遗传多样性的步伐，为不同来源和不同复杂程度基因组的分析提供了有力的工具。由Zabeau等1992年创立的AFLP (Amplified fragment length polymorphism)技术[13]是国际上最新的DNA指纹技术。其基本原理是：基因组DNA经两种限制性内切酶酶切，形成分子量大小不等的限制性酶切片段，然后把酶切片段与有共同粘性末端的人工接头连接，连接后的粘性末端序列和接头序列作为PCR反应引物的结合位点，通过PCR反应对酶切片段进行预扩增和选择性扩增。选择性扩增产物在高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，寻找多态性扩增片段。该技术是在PCR技术和RFLP标记技术基础上发明的DNA指纹技术[14,15]。该技术兼有RFLP标记技术的可靠性和PCR技术的高效性，而且快速灵敏稳定。AFLP主要有以下特点：（1）分析所需DNA量少，仅需0.5μg。也可以用作于线粒体DNA。从线粒体中得到RFLP研究所需的几十到上百μg的DNA是很困难的。另外，AFLP反应对模板浓度的变化不敏感，DNA浓度在1000倍的范围内变化时对反应的影响都不太大，所产生的指纹图谱十分相似。（2）可重复性好。AFLP分析基于电泳条带的有或无,高质量的DNA和过量的酶可以克服因DNA酶切不完全而产生的失真，PCR中较高的退火温度和较长的引物可将扩增中的错误减少到最低限度，因而AFLP分析具有很强的可重复性。（3）多态性强。AFLP分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目，来调节扩增的条带数，具有较强的多态分辨能力。设计不同的人工接头就会相应地产生不同的AFLP引物，引物3‘端的选择性碱基数目可以是2+2、2+3也可以是3+3，这些碱基的组成也是多种多样的。由于AFLP引物设计的巧妙与搭配的灵活，使得AFLP能产生的标记数目是无限的。迄今为止，每个AFLP反应能检出多态片段之多，信息量之大，效率之高是其它任何一种分子标记所无法比拟的。（4）分辨率高。AFLP扩增片段短，适合于变性序列凝胶上电泳分离，因此片段多态性检出率高，而RFLP片段相对较大，内部多态性往往被掩盖。（5）不需要Southern杂交，无放射性危害，且不需要预先知道被分析基因组DNA的序列信息，是一种半随机的PCR。（6）样品适用性广[16-18]。AFLP技术适用于任何来源和各种复杂度的DNA，如cDNA，rDNA，质粒，某一个基因或基因片段,且不需要预知这些DNA的序列特征。用同样一套限制酶，接头和引物，可对各种生物的DNA进行分子遗传标记研究。（7）稳定的遗传性AFLP标记在后代中的遗传和分离中符合Mendel式遗传规律，种群中的AFLP标记位点遵循Hardy－Weinberg平衡总之，在技术特点上，AFLP实际上是RAPD和RFLP相结合的一种产物[19,20]。它既克服了RFLP技术复杂，有放射性危害和RAPD稳定性差，标记呈现隐性遗传的缺点；同时又兼有二者之长。所以该标记技术被认为是一种有效和先进的分子标记，被认为是第2代分子标记，现已被广泛用于遗传图谱构建，遗传多样性研究，基因定位和品质鉴定等方面[21-25]。近几年来，人们不断将这一技术完善发展，使得AFLP迅速成为迄今为止最有效的分子标记。
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