3。1。2基因点突变测定 8

4 结果与分析 9

   4。1四种杀菌剂敏感性的初步测定结果 9

   4。2多菌灵和戊唑醇对尖孢镰刀菌的抑菌效果分析 10

   4。3多菌灵抗药性分子机制分析 11

   4。4 讨论 12

5 全文总结与展望 14

参考文献 15

致谢 17

1 引言

杭白菊（white Chrysanthemum morifolium）系菊科多年生草本植物，也称杭菊、茶菊。作为我国传统的药食两用栽培植物，是浙江省八大名药材“浙八味”之一[1]，味甘清热，常用来平肝明目，清热解毒。西医研究发现，菊花中含有大量的药用成分，具有降血压、抗菌、抗病毒等多种生理活性[2]。但近年来因连作、重肥、气候、环境等原因，杭白菊病害问题日益突出，令杭白菊植株的健康受到了威胁，其中的典型病害就包括叶枯病、根腐病等。在王呈辉等的研究中发现，在浙江的磐安、桐乡地区，尖孢镰刀菌（Fusariam oxysporum）能引发杭白菊的叶枯病[3]。然而实际生产中，由于农民缺乏准确高效的病害识别与无害化治理技术，时常难以避免地造成化学农药的不合理使用，致使农药污染和化学药品残留超标，引发了严重的病原菌耐药问题，严重影响了杭白菊的安全卫生质量，同时也影响到了它的药理品质。文献综述

目前，化学农药仍是植物病害防治最重要的措施。20世纪60 年代末70 年代初，随着高效、内吸、选择性强的现代杀菌剂被开发和广泛应用，病菌对杀菌剂抗性越来越普遍和严重，导致植物病害化学防治失败，农业生产遭受巨大损失。因此，许多国家和地区相继开展了对杀菌剂抗性的研究。研究发现，对于常用的几类杀菌剂，包括苯并咪唑类（benzimidazoles，MBC）、二甲酰亚胺类（dicarboximidesfungicides，DCFs）、麦角甾醇C-14α脱甲基抑制剂类（demethylation inhibitors，DMIs）、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（strobilurins)和苯基酰胺类杀菌剂（phenylamides，PAFs）均有抗性问题发生[4, 5]。药用植物病害的抗药性问题也时有报道。如已报道对苯并咪唑类杀菌剂产生抗性的病原菌有禾谷镰孢（Fusarium graminearum）、油菜菌核（Sclerotinia sclerotiorum）、柑橘青霉菌（Penicillium expansum）、苹果炭疽病菌（Glomerella cingulata）、黄瓜黑星病菌（Cladosporium cucumerinum）和番茄叶霉病菌（Cladosporium fulvum）等[5, 6]。当抗性频率达到一定数值时，农药的正常用量将会失去防效[7]。同时，抗性机制的研究发现，引起病原菌抗药性的原因主要有3种，包括：（1）药物靶标基因点突变；（2）药物靶标基因过量表达；（3）依赖ATP的药剂外排机制。这3种机制可以单独存在或组合存在，造成了病原菌抗药问题的复杂性。如于俊杰通过禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性分子机制的研究发现禾谷镰孢菌β-微管蛋白第167位氨基酸突变体、第198位氨基酸突变体以及第200位氨基酸突变体对多菌灵、苯菌灵、噻菌灵和甲基托布津的敏感性均有所下降[8]。弄清当前农药防治效果及病原真菌抗药机制，有助于及时快速掌握当前抗性问题及抗性频率，科学地指导田间用药[9]。

立足于大量前期工作，实验室从浙江省磐安和地区进行采样工作，从样品中分离获得病原真菌，并采用ITS-PCR技术，并结合形态特征和光学显微结构观察方法对浙江省主产的杭白菊进行病原菌的分离鉴定，进行致病性实验，阐明新病害特征及其发生发展规律，实现对浙江地区药用植物病害的系统认识。在此基础上，本研究以具有代表性的杭白菊叶枯病病原真菌及其主治药物为研究对象，测定多菌灵、异菌脲、戊唑醇和腐霉利等化学农药对病害的防治效果，了解病原菌对于最普遍的施用的多菌灵的抗药性频率，通过抗药性分子机制的研究明确产生抗性的原因，同时为病害治理提供科学的指导意见。