AFLP分子标记鉴别江苏省稗草种的初步研究(4)
1.3.5 AFLP 标记的关键技术
AFLP 分析步骤多，流程长，对操作人员的素质要求较高。现将AFLP 标记技术的主要技术关键总结如下4 个方面。
（1） 模板DNA 的质量
AFLP 中模板DNA 用量少，但是对DNA 的质量要求严格。基因组DNA 是否消化完全是AFLP 分析成败的决定性因素，因此分离到高质量的基因组DNA 至关重要，基因组DNA260/280 的值应为1.8 左右。在制备DNA 的过程中要特别注意避免核酸酶及各种失活物质的污染。
（2） 限制性内切酶的选择和组合
限制性内切酶的选择对AFLP 分析的准确度具有关键性作用，其选择要根据分析对象的种类和所要达到的分辨度决定。AFLP 分析可以采用的酶有许多种， 包括EcoRI、HindⅢ、ApaⅠ、TaqⅠ、MspⅠ、HpaⅡ、MseⅠ、PstⅠ等。一般采用两种不同限制性内切酶(四碱基和优尔碱基)，不同物种基因组的AFLP 分析过程中，所选用的限制性内切酶也不尽相同。EcoRI 可靠、高效而价廉，是优尔碱基内切酶的首选酶类。四碱基内切在分析植物和微生物基因组时大多选用MseI。因为其基因组内富含 A-T 序列，而MseI 的识别序列为TTAA，与其它四碱基内切酶相比，在植物中我们通常选择EcoR-MseI 组合，可以获得更多的便于PCR 扩增和凝胶电泳分离的小片段DNA。
（3）引物和接头
引物和接头合成是AFLP 技术中重要的步骤，AFLP 技术的独特之处就在于人工设计合成了限制性内切酶的通用接头以及可与接头序列配对的专用引物，为此在不需要事先知道DNA 序列信息的前提下，就可对酶切片段进行传统的PCR 扩增。接头是人工合成的一段短核苷酸双链，由一个通常长11～17 碱基的中心序列和内切酶识别序列组成。除了与相应的酶相匹配的粘性末端不同外，低频内切酶的接头与EcoRI接头(5'- CTCGTA- GACTGCGTACC- 3')相同，TaqI 与Msel 接头(5'- GACGATGAGTCCTGAG- 3')相同。AFLP 的PCR 引物由3 部分组成，与连接器序匹配的中心序列，相应的酶切位点和3' 端的选择碱基。引物的设计是PCR 扩增的关键，而引物设计主要在选择碱基数目及组合上。可采用同位素(r33P)ATP,T4DNA连接酶进行末端标记，也可以采用生物素标记或荧光标记，如EcoRI引物：5'GACTGCGTACC AATTC NNN 3'中心序列EcoRI 切点选择性碱基
（4）反应条件
在利用AFLP 技术分析较为复杂的基因组时，酶切片段要经过连续两次PCR 扩增。第一次PCR 扩增反应(预扩增)，引物中只含一个或不含选择性核苷酸，预扩增反应条件与常规PCR 反应条件也大致相同，然后利用具有3 个选择碱基的引物进行扩增，可以提高指纹图谱的清晰度，也可以减少扩增过程中的非特异谱带。因为预扩增反应对选择扩增反应的模板起到了选择性纯化作用，也为以后的AFLP 分析提供了足够的模板。DNA 选择性扩增的反应条件与普通PCR 有所不同，它是采用温度梯度PCR。其PCR 开始于高温复性(一般采用65℃)以期获得最佳选择性。以后复性温度逐步降低0.7，一直降到复性效果最好的温度(一般是56℃)。然后保持这个复性温度，完成其余的PCR 循环周期[14-16]。
1.3.6 AFLP技术展望
在生物种群区分和鉴定方面，AFLP技术显示出巨大优势，其一次检测的位点数之多是其它分子标记所无法相比的。随着应用的深入，AFLP在植物育种遗传标记方面应用最广泛，在构建植物遗传图谱、遗传多态性研究、种质资源鉴定、作物育种辅助选择等众多领域有着其它分子标记技术不可比拟的优势。
AFLP标记无法比拟的优点，和cDNA-AFLP的出现，使AFLP技术得到了快速的推广和应用。通过阅读近年来的资料，统计分析发现，用AFLP标记进行研究的文献比率呈逐年上升趋势。随着AFLP操作步骤的简单化、规范化和自动化，AFLP分析的效率会进一步提高，应用范围会不断扩大，AFLP标记将成为遗传学和分子生物学工作者手中强有力的研究工具[17-20]。
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