待提取的铁蛋白液足够多的量时,一部分进行铁蛋白电泳纯度分析和氨基酸组成测定。另一部分则用冷冻干燥机进行冷冻,干燥获得粗铁蛋白固体粉末,待加工功能试验需用。
2.3.2大豆铁蛋白的纯度分析
参照Laemmli方法(1970)对提取的粗铁蛋白质溶液进行Native和SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳[9~10]。具体方法:
Native-PAGE凝胶浓度为4-20%梯度胶,电泳缓冲液为Tris-HCl(0.025 M, pH 8.3);样品缓冲溶液中含有25%甘油,12.5% 0.5 M Tris –HCl pH 6.8及1%溴酚兰,每孔点样15 μL,Marker 6 μL,在4 ℃、25 V条件下进行电泳13 h。
SDS-PAGE凝胶浓度为15%,电泳缓冲液为Tris-HCl(0.025 M, pH 8.3, 10% SDS);样品缓冲溶液中含有25%甘油,12.5% 0.5 M Tris –HCl pH 6.8,2 % SDS,1%溴酚兰和5%β-巯基乙醇,每孔点样15 μL,Marker 6 μL,充分混合后在95℃的水浴中保持5 min,然后在常温下下进行电泳。
胶板大小为80 mm(W)×73 mm(H)× 0.75 mm(T)。电泳结束后用考马斯亮蓝(CBB)R-250 染色法进行染色(朱厚础,1999)。
Native-PAGE电泳蛋白质Marker为:甲状腺球蛋白(669 kDa); 马脾铁蛋白(440 kDa);过氧化氢酶(232 kDa);乳酸脱氢酶(140 kDa);牛血清清蛋白(66 kDa)。
SDS-PAGE电泳蛋白质Marker为:磷酸化酶B(97.4 kDa);牛血清清蛋白(66.2 kDa);兔肌动蛋白(43 kDa);牛碳酸酐酶(31 kDa);胰酶抑制剂(20.1 kDa);溶菌酶(14.4 kDa)