摘要:（S）-N-BOC-3-羟基哌啶（S-BHP）是多种医药的重要中间体，是一个极其有用的 手性砌块。本课题组在前期工作中发现的一株能够催化 N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮不对称还 原为（S）-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的埃切毕赤酵母，可以高选择性催化 boc-酮的还原。 本课题的主要任务就是利用基因克隆技术对埃切毕赤酵母基因组中预测的醇脱氢酶/酮还 原酶进行克隆表达，为后续的活性筛选奠定基础。我们通过 PCR 技术获得预测的 20 个醇 脱氢酶/酮还原酶的基因片段，用同样的限制性内切酶对它们以及 PET-28a 质粒载体进行 双酶切，构建成新的且有自主复制能力的重组质粒。最后将构建的重组质粒转化进入宿主 细胞大肠杆菌中去表达。66264

毕业论文关键词： (S)-N-BOC-3-羟基哌啶、毕赤酵母、醇脱氢酶、生物催化

Cloning and expression of recombinant alcoholdehy drogenase from Pichia etchellsii

Abstract: (S) -N-BOC-3-hydroxypiperidine (S-BHP) is an important intermediate for a  variety

of pharmaceuticals, it is an extremely useful source of reaction. In this work group, we found an anticyclonic compound capable of catalyzing the asymmetric reduction of N-tert-butoxycarbonyl-3-piperidone to (S) -1-tert-butoxycarbonyl-3-hydroxypiperidine Yeast can be highly selective for the reduction of boc-ketone. The main task of this topic is to clone the predicted alcohol dehydrogenase / ketoreductase in the genome of the Pichia pastoris by gene cloning, which lays the foundation for the subsequent activity screening. We obtained the predicted 20 alcohol dehydrogenase / ketoreductase gene fragments by PCR, digested them with the same restriction endonuclease and the PET-28a plasmid vector, and constructed the new and self-replicating Ability to Recombinant Plasmid. Finally, the recombinant plasmid was transformed into the host cell Escherichia coli to express.

Key   words:   (S)-N-boc-3-hydroxypiperidine,   Pichia   pastoris,   thalidomide   reduction    ，biocatalysis

目录

1 研究背景 1

1.1 手性合成的简介 1

1.2 手性药物的发展 1

1.3 酶在生物催化方面的应用 2

1.4 酮还原酶在手性药物合成中的应用 3

1.4.1 还原酶不对称还原 α-羰基 4

1.4.2 还原酶不对称还原 β-羰基 5

1.4.3 异源表达的还原酶不对称合成手性醇 5

1.5 本课题的研究 5

1.5.1 研究意义和目的 5

1.5.2 研究思路 7

2 实验原理和技术流程 7

2.1 实验原理 7

2.1.1 目的基因的获取方法 8

2.1.2 目的基因的重组表达 8

2.1.3 琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 的检出 9

2.2 埃切毕赤酵母菌醇脱氢酶的基因克隆技术流程 9

3 实验材料和内容 10

3.1 实验材料 10

3.1.1 常用实验试剂 10

3.1.2 常用实验仪器 12

3.1.3 培养基成分 12