2材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验动物

 雄性8周龄ICR小鼠,购自国家啮齿类实验动物育种中心分公司(上海,中国),体重为31±2g。将小鼠在湿度60%,恒温(23°C±1°C),光照/黑暗循环(光照时间为08:30–20:30)环境下饲养,饮水、摄食自由。实验室条件下适应一周后,小鼠随机分为四组(每组6只)。每组连续12周进行以下处理:每天以玉米油及0.1%Tween无菌水灌胃对照组(Control)组;每天以BDE-47(150mg/kg)灌胃BDE-47组;每天以BDE-47(150mg/kg) + Troxerutin(150mg/kg)灌胃BDE-47+Troxerutin组;每天以Troxerutin(150mg/kg)灌胃  Troxerutin组。

2.1.2 药品及试剂论文网

玉米油(购自Sigma-Aldrich),BDE-47(纯度>98%,购自Chem Service),曲克芦丁(纯度>99%,购自宝鸡方晟生物开发有限公司),ALT、Cu,Zn-SOD和GPx测定试剂盒(购自南京建成生物工程研究所),GSH检测试剂盒(购自Cayman Chemical),苏木精及伊红(购自Sigma-Aldrich),rabbit anti-4-hydroxynonenal (4-HNE) antibody (购自Alpha Diagnostics), Texas Red-conjugated anti-rabbit IgG (购自Vector Laboratories), DAPI (购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。

2.2 实验器材

紫外-可见分光光度计(日本岛津公司生产,型号UV-2501 PC ),高速匀浆器(德国IKA公司,型号T10 basic) ,冷冻台式高速离心机(德国Eppendorf公司生产,型号为5810R)。荧光显微镜(德国Zeiss,型号Axioskop 40)。

2.3  实验方法

2.3.1 血清及肝脏组织的制备

饲喂20周后,过夜禁食,将小鼠深度麻醉、处死,迅速获取小鼠肝脏及血浆组织并称重,立即处理进行实验,或保存在-80°C 冰箱中,肝脏系数表示为(g/100g体重)。将血浆冷冻1h,然后以3,000×g的转速离心5分钟获取血清。

2.3.2 ALT的测定

分光光度法测定血清ALT水平,测定方法参照试剂盒说明书(建成生物技术研究所,南京,中国)。ALT的活性表示为U / L。

2.3.3 ROS检测

利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测,荧光探针是一种无荧光的脂溶性物质,它能够自由穿过细胞膜。进入细胞后,酯酶能够将其水解生成DCFH,该物质与ROS 发生氧化反应后生成具有强荧光的DCF。DCF的荧光值反映了细胞内活性氧的水平。

将肝脏匀浆液按1:20的比例稀释,加入 DCFH-DA溶液混匀,室温下放置45min,在激发光484nm,发射光530nm条件下读取荧光产物DCF的荧光值。用不加组织匀浆液的反应混合物测定背景荧光。绘制DCF标准曲线,计算ROS的含量,ROS的含量表示为DCF formed/min/mg protein。

2.3.4 小鼠肝脏组织SOD和GPX的活力测定

SOD和GPX活力测定参照试剂盒说明书(建成生物技术研究所,南京,中国)的方法进行。

2.3.5 小鼠肝脏组织GSH测定

在组织样品与5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)反应后,在405 nm波长下,用酶标仪检测GSH含量。GSH水平表示为μmol GSH/ mg protein。

2.3.6 肝脏组织切片

将肝脏组织块置于新鲜的4%多聚甲醛/PBS溶液(pH7.4)中4℃固定4h,换至新鲜的10%,20%,30%的梯度蔗糖/PBS溶液(pH7.4)中4℃放置,直至组织块沉入蔗糖/PBS溶液底部。然后以OCT(opti-mum cutting temperature compound)包埋剂将肝脏组织块包埋,以液氮进行速冻,修块。将修好的组织块在冷冻切片机上进行切片,切片厚度为8µm,立即进行组织分析或免疫荧光实验或-80℃保存。

2.3.7 HE染色

用苏木精-伊红染色(HE染色)对小鼠肝脏进行组织分析。① 将组织切片固定30秒。 ② 水洗1~2秒。 ③苏木素染色1~3分钟。④1%盐酸乙醇分化1~3秒。 ⑤ 促蓝液返蓝10~20秒。⑥ 伊红染色10~30秒。 ⑦脱水,透明,中性树胶封固。

上一篇:Rho激酶抑制剂Y-27632在雷奈酸锶促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中的
下一篇:狼毒大戟甘草药对配伍挥发成分的GC-MS分析

综合护理茬减轻腹部外科...

中西医结合护理干预减轻...

心理护理茬减轻耳鼻喉部...

心理护理茬减轻妇科手术...

膝關节镜下多发韧带重建...

三羟乙基芦丁的制备研究【1097字】

浅议外科护理人员减轻心...

2000元做什么生意挣钱,...

《中国好声音》和《中国...

中央空调系统英文文献和中文翻译

2023年生育政策二胎還湜二...

PLC舰船舷侧隐身门梯集成...

反应物比例在LiFePO4合成上的影响

MCGS水位PID控制的仿真设计

国内外热作模具钢的研究现状情况

临床护理路径茬老年便秘...

旅游英语专业學生语言交...