2材料与方法

2．1 材料

2.1.1 实验动物

 雄性8周龄ICR小鼠，购自国家啮齿类实验动物育种中心分公司（上海，中国），体重为31±2g。将小鼠在湿度60%，恒温（23°C±1°C），光照/黑暗循环(光照时间为08:30–20:30)环境下饲养，饮水、摄食自由。实验室条件下适应一周后，小鼠随机分为四组（每组6只）。每组连续12周进行以下处理：每天以玉米油及0.1%Tween无菌水灌胃对照组(Control)组；每天以BDE-47（150mg/kg）灌胃BDE-47组；每天以BDE-47（150mg/kg） + Troxerutin（150mg/kg）灌胃BDE-47+Troxerutin组;每天以Troxerutin（150mg/kg）灌胃  Troxerutin组。

2.1.2 药品及试剂论文网

玉米油(购自Sigma-Aldrich)，BDE-47(纯度>98%，购自Chem Service)，曲克芦丁(纯度>99%，购自宝鸡方晟生物开发有限公司)，ALT、Cu,Zn-SOD和GPx测定试剂盒（购自南京建成生物工程研究所），GSH检测试剂盒(购自Cayman Chemical)，苏木精及伊红(购自Sigma-Aldrich)，rabbit anti-4-hydroxynonenal (4-HNE) antibody (购自Alpha Diagnostics), Texas Red-conjugated anti-rabbit IgG (购自Vector Laboratories), DAPI (购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。

2.2 实验器材

紫外-可见分光光度计(日本岛津公司生产，型号UV-2501 PC )，高速匀浆器(德国IKA公司，型号T10 basic) ，冷冻台式高速离心机(德国Eppendorf公司生产,型号为5810R)。荧光显微镜(德国Zeiss，型号Axioskop 40)。

2.3  实验方法

2.3.1 血清及肝脏组织的制备

饲喂20周后，过夜禁食，将小鼠深度麻醉、处死，迅速获取小鼠肝脏及血浆组织并称重，立即处理进行实验，或保存在-80°C 冰箱中，肝脏系数表示为（g/100g体重）。将血浆冷冻1h，然后以3,000×g的转速离心5分钟获取血清。

2.3.2 ALT的测定

分光光度法测定血清ALT水平，测定方法参照试剂盒说明书（建成生物技术研究所，南京，中国）。ALT的活性表示为U / L。

2.3.3 ROS检测

利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测，荧光探针是一种无荧光的脂溶性物质，它能够自由穿过细胞膜。进入细胞后，酯酶能够将其水解生成DCFH，该物质与ROS 发生氧化反应后生成具有强荧光的DCF。DCF的荧光值反映了细胞内活性氧的水平。

将肝脏匀浆液按1：20的比例稀释，加入 DCFH-DA溶液混匀，室温下放置45min，在激发光484nm,发射光530nm条件下读取荧光产物DCF的荧光值。用不加组织匀浆液的反应混合物测定背景荧光。绘制DCF标准曲线，计算ROS的含量，ROS的含量表示为DCF formed/min/mg protein。

2.3.4 小鼠肝脏组织SOD和GPX的活力测定

SOD和GPX活力测定参照试剂盒说明书（建成生物技术研究所，南京，中国）的方法进行。

2.3.5 小鼠肝脏组织GSH测定

在组织样品与5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)反应后，在405 nm波长下，用酶标仪检测GSH含量。GSH水平表示为μmol GSH/ mg protein。

2.3.6 肝脏组织切片

将肝脏组织块置于新鲜的4%多聚甲醛/PBS溶液(pH7.4)中4℃固定4h，换至新鲜的10%，20%，30%的梯度蔗糖/PBS溶液(pH7.4)中4℃放置，直至组织块沉入蔗糖/PBS溶液底部。然后以OCT(opti-mum cutting temperature compound)包埋剂将肝脏组织块包埋，以液氮进行速冻，修块。将修好的组织块在冷冻切片机上进行切片，切片厚度为8µm，立即进行组织分析或免疫荧光实验或-80℃保存。

2.3.7 HE染色

用苏木精-伊红染色(HE染色)对小鼠肝脏进行组织分析。① 将组织切片固定30秒。 ② 水洗1～2秒。 ③苏木素染色1～3分钟。④1%盐酸乙醇分化1～3秒。 ⑤ 促蓝液返蓝10～20秒。⑥ 伊红染色10～30秒。 ⑦脱水，透明，中性树胶封固。