2 实验材料

2.1 实验仪器

数显恒温水浴锅（DK-8D，上海精宏），CO2培养箱（HF151，Heal Force），单人双面垂直净化工作台（VS-840-2，上海博讯），倒置显微镜（TS100，Nikon），离心机（Eppendorf，5417），分光光度计（Eppendorf，Biophotoeter plus），水平电泳仪（Amersham Biosciences，EPS 301），凝胶成 像系统（Tanon），电子天平（METTLER TOLEDO，PL 203），离心机（Eppendorf，5430），常规PCR 仪（K 960）。文献综述

2.2 实验试剂

DMEM 高糖培养基（Boster），新生牛血清（四季青），青链霉素（10,000units/mL penicillin and 10000 μg/mL streptomycin, Gibco），胰蛋白酶（EDTA，酚红，南京凯基），DMSO（Bio Basic），PBS，封口膜（Parafilm），Trizol （Beyotime），DEPC（BBI） ，AMV 第一链cDNA 合成试剂盒（Sangon） ，2×Taq PCR Master blue dye （BioBasic），琼脂糖（BIOWEST，G-10），50×TAE （Sangon） ，溴化乙锭（EB ，Sangon），姜黄素（BioBasic），

Triton X-100（BioBasic）。

3 实验方法

3.1 HepG2细胞的复苏

a.实验前将要用到的细胞培养瓶和枪头等需要用到的物品用报纸包好放到灭菌锅中进行121℃湿热灭菌30min。

b.配制培养液：10%的小牛血清与1%的双抗(即青霉素和链霉素，通过过滤灭菌)还有89%的原液混合，操作过程应在超净工作台上进行。配好后放于4℃的冰箱中进行保存备用。

c.将冻存的细胞从液氮罐中取出前，要先将超净工作台进行紫外杀菌，并将恒温水浴锅的电源开关打开,设定温度，使水加热到37℃并将培养液加热到37℃。

d.超净工作台开紫外30min后，将紫外关掉，把日光灯和风打开，用酒精棉把手擦一遍，然后再用酒精棉把超净工作台面和即将用到的移液枪擦干净，把灭菌好的培养瓶和枪头取出放到超净工作台上，经预热好的培养液取出擦干水后用酒精棉擦一遍后放入超净工作台留用。

e.把HepG2细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放到37℃的水中融化，在水中快速摇晃使其可在1min钟内迅速融化，以减少在复苏过程中的细胞损伤。

f.在完全融化后，转移至超净工作台进行操作：在细胞培养瓶中先加入2ml的培养液，然后将冻存管的细胞液移入培养瓶内，混匀，拧紧瓶盖，拿出超净工作台，放在倒置显微镜中观察看细胞是否分散均匀，放入细胞培养箱中进行培养时，要将瓶盖拧松半圈。

g.第二天把复苏的细胞从培养箱中取出，取出时要将瓶盖拧紧。放置在倒置显微镜下观察，若看到大部分细胞已经贴壁生长，则说明复苏细胞成功，若看到细胞大部分都悬浮着，无细胞贴壁生长，则说明细胞复苏失败。

3.2 HepG2细胞的培养

 复苏后的HepG2细胞在培养箱中培养至第二天，从培养箱中取出置于倒置显微镜上观察，细胞贴壁状况良好，可以给细胞进行换液，先在恒温水浴锅中37℃预热培养液和PBS，超净工作台开紫外杀菌半个小时后将紫外灯关闭打开日光灯和风并用酒精棉擦一遍超净工作台面和即将用到的移液枪，点上酒精灯，然后把培养液和PBS擦干再用酒精棉擦一遍后放入超净工作台内，把细胞从培养箱中取出，取出时要注意拧紧瓶盖，移至超净工作台，用酒精灯烧一下瓶口再打开瓶盖，把培养瓶中的培养液沿着细胞贴壁的对应面倒入废液缸中，倒干净后取4ml的PBS同样的沿着细胞贴壁面的对面加，装PBS的瓶打开前也要在酒精灯上烧一下灭菌。加好后，将有细胞的那一面与超净工作台面平行然后水平的前后晃动然后再沿着细胞贴壁面的对面把PBS倒进废液缸，要用PBS洗两次。洗好后就可以加入4ml的培养液进行培养了，加培养液时也是沿着非细胞贴壁面加。换液完成后可置于倒置显微镜中观察，观看培养瓶中的浮动细胞多不多，贴壁生长的细胞生长状态好不好等等。最后放到细胞培养箱中进行培养。来,自|优;尔`论^文/网www.youerw.com