摘要：目的 克隆大戟三萜合成途径中的鲨烯环氧酶基因(se)，并利用生物信息学软件对这个基因进行功能分析。 方法 提取药用植物大戟根、茎和叶的总RNA，通过电泳检测RNA的完整性，用比色法测定提取RNA的纯度和浓度。以提取的RNA为模板，参照反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，设计引物，再以cDNA为模板，进行PCR扩增然后对药用植物大戟se基因的克隆及测序，运用NCBI 的ORF Finder 在线软件分析药用植物大戟SE基因的开放阅读框并获得氨基酸序列。结果 药用植物大戟推断的SE的氨基酸序列与千金子、绿珊瑚、蓖麻、葡萄SE氨基酸序列同源性分别达到93%、88%、83%、79%。se基因在叶和茎中表达量较高，根中表达量相对较低。同时药效成分研究发现药用植物大戟根里的三萜类化合物含量较高，推测叶和茎中合成的三萜类化合物可能会运输至根中。76467

毕业论文关键词:  大戟、鲨烯环氧酶基因、反转录、PCR

   Cloning and functional analysis of squalene epoxidase in medicinal plant Euphorbia pekinensis

Abstract: Objective Cloning squalene epoxidase gene (se) of triterpenoid biosynthesis pathway in Euphorbia pekinensis and functional analysis of the gene used biological information。 Methods  Extracting total RNA of root, stem and leaf of medicinal plant Euphorbia pekinensis, using electrophoresis to detect RNA integrity, and photocolorimetry to detect RNA purity and concentration。 Then the total RNA was reverse transcribed into cDNA according to the manual of 1st strand cDNA synthesis kit。 The primers were designed, and then cDNA was used as template to  PCR amplification。 Then the se gene was cloned and sequenced。 Finally using online software NCBI ORF finder to analysis se gene open reading frame, and obtain amino acid sequence。 Results  Sequence homology of SE of medicinal plant Euphorbia pekinensis with Euphorbia lathyris, Euphorbia tirucalli, Ricinus communis, Vitis vinifera was 93 %, 88 %, 83 %, and 79 %。 The se expression in leaves and stems were higher and the se expression in root was relatively low。 At the same time the content of active components triterpenoid compound found in root of medicinal plant Euphorbia pekinensis is higher, speculated that the synthetic triterpenoid compounds in leaves and stems can be transported into the root。

Keywords :Euphorbia pekinensis ; Squalene epoxidase gene ; Reverse transcription ; PCR

目录

引言 4

1 实验材料与方法 6

1。1 材料 6

1。2 主要试剂 6

1。3 方法 6

1。3。1 药用植物大戟根、茎、叶总RNA提取 6

1。3。2 反转录及PCR扩增 6

1。3。3 药用植物大戟SE基因的克隆及测序 7

1。3。4 生物信息学分析 7

1。3。5 组织表达分析 7

2 结果与分析 7

2。1 总RNA的提取及检测 7

2。2 药用植物大戟SE基因的克隆与序列分析 8

2。3 药用植物大戟SE基因的组织特异表达 10

3 讨论与分析 12

致谢 13

参考文献 13

引言

京大戟是我国的传统中药，收录于历次版本的《中华人民共和国药典》,京大戟又叫大戟牛奶浆草、山猫儿眼草、千层塔、下马等，是大戟科大戟属植物大戟(Euphorbia pekinensis Rupr)的干燥根，大戟味苦，性寒，有毒，该药材最早在《神农本草经》有过记载，中医经常将其应用于峻下逐水药，功效泄水逐饮，消肿散结[1]。对于治疗胸膜炎积水、晚期血吸虫病腹水,肝硬化腹水及精神分裂症等一些临床症状也有显著的疗效[2]。京大戟的化学成分和药理作用现今也有了一定的研究基础，从京大戟中分离出了多种结构复杂的化合物，经药理研究发现京大戟中分离的化合物具有抗肿瘤、抗白血病、镇痛、消炎等作用[3]。临床研究发现京大戟具有治疗精神分裂症、肝硬化腹水、便秘、耕牛前胃弛缓等疗效。京大戟中分离出来的活性化合物大部分为萜类化合物。其中三萜类化合物是京大戟中的有效活性成分[4-5]。三萜类化合物是大自然中一类重要的化合物，是由数个异戊二烯去掉羟基后首尾相连构成的物质[6]，大部分三萜类化合物含30个碳原子，少量三萜类化合物为含有27个碳原子的萜类化合物[7]。在大自然里有很多物质都含有这类成分，例如灵芝、鲨鱼油、甘草、五味子等。论文网