HRP是迄今为止在ELISA中应用最为广泛的标记用酶，主要有二：其中一方面是因为易于提取，价格相对低廉；另一方面是因为HRP性质稳定，耐热及有机溶剂的作用，与抗原或抗体偶联后，其活性很少受到损失。

 酶标记的方法

主要有两种，其一为戊二醛交联法，这种方法主要通过戊二醛这种双功能试剂，来达到使酶与蛋白质的氨基联结的目的，有较好的重复性和有效性（达到60%~90%的结合率）。

但是由于交联反应的随机性，以及结合物的大小不均一性，使得酶与酶之间&抗体与抗体之间的结合，从而影响交联反应的准确性。

第二种方法为过碘酸氧化法，这种方法适用于糖含量较高的酶。过碘酸钠可以将HRP分子表面的多糖氧化为高活性的醛基，并与蛋白质上的氨基形成chiff氏碱结合。

制备好的结合物（conjugate）中一般会混有一定量的游离的酶与二抗，其中游离的酶一般不会影响ELISA反应中的酶活性鉴定，但是游离的二抗却会与酶标抗体进行对相应固相抗原的竞争，因而应对制备好的结合物（conjugate）进行相应的纯化过程后再用来进行检测，以排除游离的酶与抗体，以使ELISA实验的最终结果更加准确。

结合物的工作浓最适工作浓度，是指在维持一个极低的本体的同时，可以获得一个较高的灵敏度时的结合物的稀释浓度，在这个浓度下，可以找到最佳的测试条件及较低廉的成本。

 结合物的保存

由于酶与二抗多为蛋白质，极易失活，因而需要选用合适的保存方式进行保存，一般选用冻干的方式。冻干前须在结合物溶液中加入适量甘油，蛋白保护剂，抗生素及防腐剂。然后用封口膜封口，注意留一个小口，并放于冻干机中过夜操作。

 结合物的稀释

配置须用于防止结合物在反应中直接吸附在固相载体的稀释液，低温（4~8°C）保存。

5）酶的底物

HRP的底物

 OPD（邻苯二胺）氧化后，其产物一般呈橘红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，其优点有灵敏度高，方便比色，也是HRP常用底物之一；

根据HRP的催化特性，ELISA中一般使用过氧化氢(H2O2)作为HRP底物之一，在供氢体（即色原底物）存在时，HRP与H2O2的反应迅速而又专一。

 TMB（四甲基联苯胺）经HRP作用后其物呈现蓝色，TMB性质稳定，可以配置成溶液试剂，并且只需要和H2O2溶液1:1混合后即可配置成应用液，当酶反应终止后，产物显色由蓝变黄，一般选取主波长为OD450nm，副波长为OD630nm，读数后主波长减副波长即可得到更为准确的读数；

 ABTS（2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐）虽然不如OPD以及TMB稳定，但是其空白值较低的优点，也使得它也为一些试剂盒所采用的的对象。

总体来说，由于HRP对于氢受体的高度专一性，使得它只作用于H2O2，小分醇的过氧化物以及尿素过氧化物上。

6）酶反应终止液

常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度一般为2mol/l，并可随着加液量以及比色液的最终体积进行微调。

4 ELISA技术目前的适用范围

由于ELISA实验的高度专一性，敏感性，以及极高的准确度，现已广泛应用于医疗卫生检测，疾病的临床诊断与检查，食品中有害物质残留的检定，辅助基因工程等方面。

1）ELISA实验可以用于多种抗原，半抗原及抗体的测定

这些检测可以广泛应用于内分泌，血液，肿瘤，传染病，免疫化学方面的检测，例如：检测各种白介素（IL）因子，雌性激素，胰岛素等。也可检查凝血因  子，红细胞抗原，又或是检测甲胎蛋白，其检测水平已与其他方法相当，但是操作更加方便快捷。 ELISA实验国内外研究现状(3):http://www.youerw.com/yanjiu/lunwen_94427.html