将POM/PLLA纤维浸入浓度为60mg/mL的己二胺异丙醇溶液，在40℃条件下，缓慢搅拌，氨解反应12小时。当反应结束时，用异丙醇与蒸馏水反复冲洗数次，除去未反应的己二胺。氨解的纤维样品真空干燥，用于脂肪酶的负载。 

2。3  脂肪酶在POM/PLLA-NH2表面固定化

取一定量的脂肪酶放入10mL NHS溶液(5mM)的磷酸缓冲溶液(0。05M, pH=5。5)中4℃ 震荡水浴进行活化2h，取4 mg 己二胺改性后的POM/PLLA纤维膜，用去离子水和PBS缓冲溶液(0。05M, pH=5。5)冲洗后加入上述溶液中，随后加入10mL EDC·HCl (50mM)溶液；将上述混合反应液放入4℃的恒温振动水浴中反应12h，反应结束后，用0。05M, pH=5。5磷酸缓冲溶液反复洗涤固体化酶，用来除去未反应的脂肪酶以及杂质，最后冷冻干燥用于后续酶活性以及稳定性测定；收集结束后的溶液和PBS冲洗液用来测定未固定化酶的含量。

2。4  结构与性能表征

(1) 结构表征

采用Bruker Vertex 70v傅立叶变换红外光谱仪(美国)对酶固定化前后的薄膜载体结构进行表面衰减全反射光谱(ATR-FT-IR)表征；

利用HITACHI S4800 扫描电镜(日本)在30kV操作电压下观察POM/PLLA纤维膜的形态；

利用激光共聚焦显微镜(Nikon-A1 system，日本)观察固定化酶的形态，用于激光共聚焦显微镜观察的脂肪酶需要采用异硫氰基荧光素(FITC)进行标记，方法如下：向20mL脂肪酶溶液中加入0。1mL的FITC，在4℃下避光放置24h, 然后将酶液放置于超速离心机中以5000 rad/min离心10min除去上清液，用PBS溶解离心管中的脂肪酶，再次进行离心，连续三次。最后用PBS溶解经FITC标记的脂肪酶，按步骤2。3将其固定于纤维膜上，用于激光共聚焦显微镜观察。论文网

   利用HITACHI HT-7700(日本)透射电子显微镜在100kV工作电压下观察POM/PLLA纤维胺解反应前后的形貌。

   利用Thermal Scientific ESCALAB 250Xi(美国)X-射线电子能谱仪对纤维表面元素进行分析。

利用Kruss，DSA-100(德国)液滴形状分析仪对纤维表面的亲疏水性进行分析。具体如下，将样品用双面胶贴在载玻片上，将体积为5μL的水滴滴在膜表面，用摄像机实时拍摄液滴曲面，然后经电脑拟合Young-Laplace方程计算得出样品的静态接触角，同一样品重复5次，确保实验误差。测试液体为超纯水。

(2) 载酶量和固定化效率

图2。1 测定样品蛋白质浓度的标准曲线

采用Bradford[7]法测定步骤2。3中悬浮溶液中的酶蛋白含量，操作方法如下所示：用BSA配成1mL中含蛋白质20μg、40μg、60μg、80μg、100μg 的一系列标准液，并在上述各管各加考马斯亮G-蓝250溶液5。0mL，5分钟后，采用Shimadzu UV-2450(日本)可见分光光度计在不同样品在595nm波长处吸光度，以蛋白质含量为纵坐标，以吸光度为横坐标，绘制标准曲线，如图2。1所示。

用上述方法检测固定化前后的酶溶液，以及清洗固定化酶膜所用的PBS中蛋白含量，根据公式(1。1)计算固定化效率(Immobilization Efficiency，IE)：

IE(%)=     (式1。1)

式中：C0为固定化之前酶溶液中蛋白浓度 (mg/mL)；C为固定化反应之后酶溶液中蛋白浓度(mg/mL)；V 是固定化酶实验中所用的酶溶液的体积(mL)；Cw是冲洗固定酶膜所用的PBS缓冲溶液中的蛋白含量(mg/mL)；Vw是冲洗固定化酶膜所用的PBS缓冲溶液的体积(mL)。

相同条件下的实验重复三次以上，取平均值，保证实验误差在5%左右。

(3)固定化酶活性测定[8]

底物橄榄油乳化液中加入脂肪酶后，可以将底物水解为脂肪酸和甘油，使用标准碱溶液结合指示剂可以产物脂肪酸的量进行滴定，由耗碱量可求出脂肪酶的活性。一个脂肪酶的活性单位(U)对应于在检测条件下，每小时内从橄榄油中水解1μmol脂肪酸所需要的酶量。具体实验步骤如下： POM/PLLA纤维膜固定化脂肪酶的研究(3):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_176089.html