取两只50mL的锥形瓶，分别标记为空白瓶(A)和样品瓶(B)，分别加入配置好的PVA橄榄油乳化液5mL和4mL磷酸缓冲液。将上述两只锥形瓶放置于40℃预热5min后，向A瓶中加入1mL纯水作为空白样，向B瓶中加入1mL的酶液，此时开始计时，反应30min后，量取15mL 95%的乙醇加入两瓶中进行灭活处理，终止反应。以酚酞作为指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定产物溶液，直至溶液呈粉红色且30s内不褪色，将该点记为滴定终点，分别记录空白样A和样品B对NaOH溶液的消耗量。同一条件下的实验重复三次以上，求取平均值，实验误差在5 %左右。脂肪酶的水解的比活性(Specific Activity, SA)计算如式(1。2)所示：

SA (U/mg)    (式1。2)

式中：CNaOH是标准氢氧化钠溶液的浓度(mol/L)；ΔVNaOH是样品B与空白样A所消耗的NaOH溶液的体积差(mL)；T是反应时间(h)；bE是被测样品酶液的浓度(mg/mL)；VE是被测样品加入的体积(mL)；e%是酶中的蛋白质百分含量。

固定化酶的比活性(SAi)定义为每毫克固定化蛋白的活性单位，如式(1。3)所示：

SAi (U/mg)       (式1。3)

式中：CNaOH是标准氢氧化钠溶液的浓度(mol/L)；ΔVNaOH是样品B与空白样A所消耗的NaOH溶液的体积差(mL)；T是反应时间(h)；M是固定化酶蛋白的质量(mg )。

(4)固定化酶热稳定性测定文献综述

将1。0mg/mL的自由酶溶液于45℃水浴中恒温15h，每间隔一段时间，用移液管取出0。5mL测定其活性。另外，将多份质量相同的固定化酶膜放入于45℃水浴中，恒温15h，隔段时间，取出部分固定化酶膜测定其比活性。通过考察酶残留活性随时间的变化，研究酶的热稳定性。

因此在热稳定测试实验中酶的残留活性的计算公式如式(1。4)所示：

RA (%)=St/S0×100%    (式1。4)

式中：St是某一时刻酶或者固定化酶的比活性，S0是酶或者固定化酶的初始比活性。

(5) 固定化酶的重复使用性

取一定量固定化脂肪酶，在最适宜的条件下催化橄榄油PVA乳化液水解反应30min，然后测定固定化酶比活性，记作使用1次后的酶活性。分别测定不同使用次数后的酶活性，该酶活与未使用的等量固定酶酶活之比定义为使用后的残留活性(RA)，计算公式同式(1。4)。