1.1.4 设备
离心机(艾本德公司);硝酸纤文素膜电转系统(Bio-rad公司);垂直式电泳槽(bio-rad公司);超声破碎仪(Scientz-IID);全自动酶标仪酶联免疫吸附试验检测仪微孔板检测器(Tanon公司);全自动化学发光成像分析系统(Tanon公司)。
1.2 方法
1.2.1 兔出血症病毒传统毒株和变异毒株VP60蛋白的鉴定
1.2.1.1血凝效价测定
使用血凝反应来测定RHDV2和RHDV VP60蛋白的效价,具体的操作如下:
①现场配制1:100的人O型红血球悬液。
②横置100孔有机玻璃反应板,用多道移液器每孔滴加PBS50 μL,加50 μL抗原样品(反复冻融过的RHDV2和RHDV VP60蛋白悬液)于第一孔中,吹打混匀,注意设置对照孔。
③50 μL于第二孔中,如此同上连续稀释直至第10孔,于第十孔用移液器吸取50μL混合液体弃去。
④每孔滴加50 μL人O型红血球悬液,置于4℃冰箱中反应30-40分钟。
⑤判定结果;
对照孔红细胞将明显的钮扣状沉到孔底可进行判定。
将板倾斜,观察血凝板,判读结果将板倾斜(45度左右),观察血凝板。
判读结果:
++++:红细胞全部凝集,呈红色血点铺于孔底,即100%红细胞凝集。
+++:红细胞凝集基本同上,但孔底有大圈。
++:红细胞于孔底形成中等大的圈,四周有小凝块。
+:红细胞于孔底形成小圆点,四周有少许凝集块。
-:红细胞于孔底呈小圆点,边缘光滑整齐,即红细胞完全不凝集。
能使红细胞完全凝集(100%凝集,++++)的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价,此效价为1个血凝单位(HAU)。对照孔应呈现完全不凝集(-),否则此次检验无效。
1.2.1.1 Western-blot分析 兔出血症病毒传统毒株和变异毒株VP60蛋白多克隆抗体的制备及其鉴定(3):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_23224.html