鲨烯环氧酶（squalene epoxidase，SE），又叫鲨烯单加氧酶（squalene monooxygenases），它能催化鲨烯双键发生环氧化反应，生成2,3-氧化鲨烯 ，这是三萜类化合物合成途径中的第一步氧化反应，再经过一系列的反应最终生成三萜类、甾醇、胆固醇等重要萜烯类物质，这些萜烯类物质的产量是由SE基因的表达量和活性所决定的，所以SE是此类物质合成过程中一个关键限速酶[8-9]。目前已从人参[10]、刺五加[11]、绞股蓝[12]、远志等多个植物中克隆了SE基因。本次研究克隆了京大戟鲨烯环氧酶基因，同时对该基因进行了生物信息分析，并对药用植物大戟根茎叶组织中的羊毛甾醇含量进行了分析，以及对SE基因的表达差异进行了分析，讨论表达量在药用植物大戟三萜类含量与SE基因之间具有怎样的关系以及关系程度如何，希望实验所得结论能为京大戟三萜合成机制的研究作进一步的贡献，也希望能对如何通过基因工程来提高我国中药材的质和量等方面的问题作出一些合理的解答，因为中药产品在我国的地位不容小觑，但是传统的中药材品质不是很高，这就使得中药材浪费严重，所以此类研究就显得尤为必要。文献综述

1 实验材料与方法

1。1 材料

 药用植物大戟取自于江苏师范大学后山。经ITS序列鉴定为药用植物大戟。

1。2 主要试剂

 植物RNA提取试剂盒购自天根生物科技有限公司，反转录试剂盒购自宝生物（大连）有限公司、高保真酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNA连接试剂盒、qPCR 试剂盒购自Transgen生物科技有限公司。

1。3 方法

1。3。1 药用植物大戟根、茎、叶总RNA提取 

    依据植物RNA提取试剂盒的提取步骤，提取药用植物大戟根、茎和叶的总RNA。总RNA通过电泳来检测RNA的完整性，再用比色法测定提取RNA的质粒和浓度[13]。

1。3。2 反转录及PCR扩增

    以药用植物大戟根的总RNA为模板，参照PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书反转录成cDNA，-20℃保存备用。根据前期测的转录组序列设计引物，上游引物为BXSE1F: 5’-ATGGAAGTCGTCTTTGAGACCTAC -3’；下游引物为BXSE1R: 5’-CTAGTTTGAGTTCTGCACCTCAAC-3’。以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为：去离子水18μL，2 × Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix (10 mM each) 1μL，cDNA 1μL，引物各1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL。反应程序：95 ℃预变性1 min; 95 ℃变性15s， 60 ℃退火15s，72 ℃延伸1 min，35 个循环，最后72 ℃延伸5min。取5 μL 扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测[14]。

1。3。3 药用植物大戟SE基因的克隆及测序

将获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA胶回收试剂盒纯化回收，连入pEASY-Blunt Cloning Vector（Transgen），转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选，将获得带有目的片段的阳性克隆质粒进行测序，测序由上海生工完成[15-16]。来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

1。3。4 生物信息学分析

运用NCBI 的ORF Finder 在线软件分析药用植物大戟SE基因的开放阅读框并获得氨基酸序列。采用ExPASy在线服务器的Compute Pi/Mw工具预测氨基酸序列的相对分子质量与理论等电点，PSORT 服务器预测蛋白质的亚细胞定位；使用ExPASy 在线服务器的GOR 软件预测二级结构(https://npsa-prabi。ibcp。fr/cgi-bin/npsa_automat。pl?page=/NPSA/npsa_gor4。html)，通过protein blast寻找相似性序列，选择与药用植物大戟SE氨基酸序列相似性较高的不同来源的SE 氨基酸序列，利用ClustalW2 软件对这些氨基酸序列进行多序列比对[17]。 药用植物大戟鲨烯环氧酶基因克隆与功能分析(2):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_87729.html