利用冰晶核蛋白构建磷酸盐吸附蛋白大肠杆菌细胞表面展示体系(2)
时间:2016-12-18 20:31 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
磷酸盐吸附蛋白N末端含有25个氨基酸残基的信号肽序列，通过ABC（ATP-binding cassette）转运系统帮助PBP蛋白转运至细胞周质。成熟的PBP蛋白包含321个氨基酸残基，分子量大小约为34 kDa，缺乏半胱氨酸和甲硫氨酸[8]。对PBP蛋白结构分析表明，在80位缬氨酸处有一极为疏水的结构，这一疏水核心不含二硫键，对PBP蛋白的活性构象起稳定作用。PBP蛋白含有的四个精氨酸残基在与底物磷接触及结合作用中起重要作用[13]。三文结构分析表明，PBP蛋白可分为两大结构域，这两个结构域铰合在一起，中间形成疏水缺口，当磷酸盐结合到缺口处时，两结构域紧密围绕磷酸盐将其包裹其中，便于跨膜运输至细胞周质[14]。 1.3 本课题的研究目的和意义 由于大量含磷污水的排放造成了水体富营养化，因此污水流入环境之前必须通过污水处理的方法，将含磷化合物去除。污水中的磷通常以磷酸盐，聚磷酸盐和有机磷的形式存在，聚磷酸盐在酸性条件下可水解为磷酸盐，有机磷酸盐也可被水中细菌生物酶作用下转化成磷酸盐，因此，磷酸盐的去除是污水除磷的关键 磷是细菌细胞生长和代谢不可或缺的重要元素。磷元素的获得主要通过从环境中摄取磷酸盐等含磷物质，运输进入细胞内部，以达到为细菌细胞自身利用的目的。这一过程中涉及到磷酸盐的吸收运输调控机制以及表达的一系列相关蛋白。磷酸盐吸附蛋白不仅可作为生物传感器检测磷酸盐[9]。还可用于吸附水中的磷酸盐，达到净化的目的。生物除磷技术因具有节约能源、运行费用低、可减少污泥膨胀、避免二次污染的优点，而成为目前去除水体中磷的研究热点。 目前许多菌属都有摄取磷酸盐等含磷物质的生物特性，但在污水处理过程中，很少有高效聚磷能力和特性稳定的工程菌得以应用。从国内外对聚磷基因的研究来看，磷酸盐吸附蛋白（PBP）和磷酸盐外切酶（PPX）的基因克隆以及磷酸盐转运系统中相关蛋白是研究的热点。因此，构建高效的工程聚磷菌不仅有助于解决水体磷元素的富营养化问题，同时还将在分子水平上阐明聚磷菌的聚磷机理及其相关基因的表达调控。 1.4 本课题研究的主要内容 根据实验室已有的工作基础，通过GenBank数据库DNA序列比对，设计合适的简并引物，用PCR的方法扩增得到大肠杆菌磷酸盐吸附蛋白编码基因phoS，将3拷贝冰核基因与phoS基因融合，构建能表面展示磷酸盐吸附蛋白PBP的大肠杆菌工程菌，通过工程菌磷酸盐吸附能力的测定初步测定融合蛋白的表达。 2.材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1材料与试剂 （1） 主要分子生物学试剂： Taq酶（5U/μL），10×扩增缓冲液，MgCl2（25mmmol/L），dNTP混合物（10mmol/L），去离子水，进口琼脂糖，TE缓冲液：10mmol/L Tris-Cl（pH8.0）、1mmol/L EDTA，10×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝（BPB）、40%蔗糖、10mmol/L EDTA（pH8.0），酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），3mol/LNaAc（pH5.2），预冷无水乙醇，预冷70%乙醇，0.1 mol/L CaCl2，磷酸二氢钾标准溶液（含0.1 mg/mL PO43-），钼酸钠-硫酸溶液（1%(w/v)钼酸钠，10%(v/v) H2SO4）。 （2） 菌株：大肠杆菌JM109和MG1655。 （3） 重组质粒：pTrcHisC-3inpN-gfp 2.1.2实验仪器与设备 Eppendorf管，微量移液枪，枪头，制冰机，冰盒，PCR扩增仪，低温离心机，微波炉，电泳槽，电泳仪，培养皿，量筒，烧杯，涂布棒，锥型瓶，灭菌锅，接种环，摇床，烘干机，试管，电子天平，紫外光仪，煤气灯，药匙，称量纸，手套，分光光度仪。 2.2实验方法2.2.1试验流程 大肠杆菌 JM109 pMB110 (责任编辑：qin) |