利用冰晶核蛋白构建磷酸盐吸附蛋白大肠杆菌细胞表面展示体系(3)
时间:2016-12-18 20:31 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
pTrcHisC- 3inpN-phos 设计引物 phos pMD-19T-phos 2.2.2 培养基制备 LB培养基的配方如下: 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L ，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L ，氯化钠(NaCl) 10g/L 另外根据经验值用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4(该pH适合目前使用最广的原核表达菌种E.coli的生长) LB固体培养基配置 （1）配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉 （2）.氨苄青霉素Amp的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 抗生素终浓度Amp 100ug/ml，氨苄青霉素加入前已经过滤除菌。 2.2.3 设计简并引物 设计简并引物原则：引物长度15-40bp，引物碱基尽可能随机分布（G+C约60%），引物内部链避免二级结构，引物碱基序列不应与非扩增区域有同源性或少于连续8个的互补碱基，引物的3‘端为关键碱基 ，引物长度大于16bp,一般为20-24个核苷酸，引物与靶序列间的Tm值不应过低，引物不应有发夹结构。即不能有4bp以上的回文序列，两引物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列，在3’端不应有任何互补碱基，引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近50%。 根据从GeneBank上查找到磷酸盐吸附蛋白（phosphate binding protein）编码基因序列，设计用于PCR扩增phos基因引物序列： Phos1（上游引物）：5'-GGAAGATCTGAAGCAAGCCTGAC-3’ Phos2（下游引物）：5'-CCGGAATTCTTAGTACAGCGGCT-3' 引物是PCR扩增必须的，包括保护性碱基，限制性内切酶酶切位点，phos基因序列。是根据多条大肠杆菌phos基因序列分析设计的。 2.2.4 pMB110质粒的提取 将包含质粒pMB110的大肠杆菌JM109 在LB液体培养基中培养过夜， 提取pMB110质粒用常规碱法抽提。 (1).取1.5ml细菌培养物于EP管中，9000rpm离心30秒，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥； (2).将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100 µl溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，剧烈振荡是沉淀悬浮； (3).加入200 µl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中； (4).加入150 µl预冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟； (5). 12000rpm离心5min，取上清液于另一新EP管； (6).用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟； (7).小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽； (8).加1ml 70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～10分钟），用适量的ddH2O溶解； (9).用0.5µl的RNase 37℃温育5~10分钟； (10).电泳鉴定。 2.2.5 聚合酶链式反应PCR扩增phos基因 PCR反应原理：PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95度时解旋，55度时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至72度左右，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。由PCR技术制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在95℃，55℃，72℃之间很好地进行控制。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： (责任编辑：qin) |