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适合用作秋水仙素诱导多倍体的实验材料。 本项目首先从矮牵牛叶片中诱导获得毛状根，进一步利用秋水仙素处理，获得染色体加

倍的毛状根，并进行鉴定，为培养多倍体花卉植物提供遗传学基础。 

1材料与方法

1。1 材料

矮牵牛组培苗，由本实验室前期实验获得。野生型发根农杆菌 K599 由本实验室在-80℃ 冰箱中保存。 

1。2 发根农杆菌 K599 的培养与活化论文网

将发根农杆菌 K599 从-80℃的冰箱中取出，用无菌的接种针蘸取少许发根农杆菌 K599 在含有 50mg/L Str(链霉素)的 LB 平板上划线培养，置于 28℃的暗培养箱 2-3d。从平板 上挑取农杆菌单菌落接种于含有 50mg/L Str 的 LB 液体培养基中，置于摇床上(28℃， 200r/min)振荡培养 16-20 h。 

当农杆菌的生长密度达到 OD 值约为 0。5 时，取 1 mL 菌液加入 1。5 mL 离心管中，4000 r/min 离心 5min，去上清，用 MS 液体培养基悬浮菌体两次，获得 OD 值约 0。1 的菌液， 用作侵染液。 

1。 3 发根农杆菌 K599 侵染及毛状根的诱导培养

将已预培养的矮牵牛叶片切块置于已制备好的侵染液中，室温下 80-100 r/min 摇床上 振荡 10 min。通过共培养、脱菌、筛选培养后长出毛状根，剪取叶片上的不定根，接种到 MS＋500 mg/L Cef（头孢霉素）固体培养基中进行培养，待农杆菌完全杀死后直接转入 MS 固体培养基上培养。

1。 4 毛状根的 PCR 鉴定

毛状根采用 CTAB 法提取基因组总 DNA，以提取的样品 DNA 为模板进行普通 PCR 扩增。提取具体步骤如下：①。取毛状根于研钵内，加液氮研磨成细粉，转移到 50ml 的离 心管中，加入事先预热的提取液 20ml。②。将 50ml 的离心管来回颠倒数次，65℃水浴 1h， 期间振荡几次，随后在 37℃振荡 30min，加入 20ml 氯仿：乙醇：异戊醇(80:16:4,v/v), 轻轻摇匀，4℃、11000r/min 离心 10min。③。取上层液相再加入 20ml 氯仿：乙醇：异戊 醇(80:16:4,v/v),轻轻摇匀，4℃、11000r/min 离心 10min。④。取上层液相，加入等体 积的异丙醇沉淀，，4℃、11000r/min 离心 5min。⑤。弃上清液，沉淀用 70%的乙醇清洗 2 次，室温下干燥后溶于 ddH2O 中备用。 文献综述

根据 K599 T-DNA 携带的 rol B 基因序列，Zhang et al (2011)[8]的报道的方法，设 计 并 合 成 引 物 rolB-P1: 5'-gccagcatttttggtgaact-3' 和 rolB-P2: 5'-ctggcccatcgttctaaaaaa-3'。利用上述引物进行 PCR 扩增验证，PCR 反应体系见表 1。 PCR 反应程序为：94℃ 5min 变性后，按 94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 90s 的设置进行 30 个循环，反应结束后在 72℃下延伸 10 min，随后于 4℃保存备用。扩增产物在 1。2%琼 脂糖凝胶上电泳 1。5 h（5 V/cm），溴化乙锭（EtBr）染色，用美国 Bio/Rad 凝胶成像系 统观察并拍照记录。