植物络合素在小麦响应砷胁迫过程中的作用及其测定方法(2)
时间:2018-07-05 20:04 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
(Schizosaccharomyces pombe)中分离得到的。此后，结构功能与之相似的另外4类⼩分 ⼦多肽相继被发现。植物中产⽣的PCs种类依物种和品种及诱导的重⾦属种类的不同⽽ 不同。 ⽬前为⽌，植物络合素的测定⽅法主要有分光⽐⾊法、凝胶过滤法、液相⾊谱法和 ⽑细管电泳法，其中以液相⾊谱法最为常见。由于巯基化合物的极性较强，易氧化、难保留， 且在紫外光区⽆吸收、⽆荧光特性，因此柱前或柱后 衍⽣技术成为⽬前巯基 化合物分析的常⽤⼿ 段。 其中最经典的⽅法是 Ellman 试剂(5，5ʹ⁃ ⼆巯双(2⁃硝基苯甲 酸)， DTNB) 柱后衍⽣紫外检测法[2] ，但该⽅法需要特殊的柱后反应器，且存在 分析 时间长、灵敏度不够⾼( 检出限为 nmol 量级) 等缺点。 柱前衍⽣液相⾊谱⁃质谱联⽤技 术虽具有 较⾼的灵敏度(检出限可达 pmol 量级)，但仪器设 备昂贵，分析费时[2；3] 。 ⽽超⾼效液相⾊谱（ UPLC ）检测可以解决上述问题，与传统的⾼效液相⾊谱 （HPLC）相⽐，UPLC具有很多优势：⾼分离，⽽根据范迪姆特（Van De emt e r）⾊谱 理论，柱效反⽐于系统固定相粒度⼤⼩。UPLC系统运⽤的固定相粒度能达到1.7μm， 根据上述⽅程，该系统达到的效能将⽐5μm粒度系统⾼70%，⽽⽐3.5μm⾼40%；⾼速 度，在保证得到同样质量数据的前提下，UPLC能提供单位时间内更多的信息量；灵敏 度，UPLC能提⾼柱效N，从⽽使峰宽w变的更窄，⽽峰⾼却增加了，同时，由于UPLC 运⽤了更短的柱⼦（柱长L更⼩），进⼀步增加了峰⾼。因此，在提⾼柱效的同时，运 ⽤1.7μm的UPLC系统⽐5μm和3.5μm的系统灵敏度分别提⾼了70%和40%，⽽在柱效下 相同情况下，能分别提供3倍和2倍的灵敏度；成本低，与HPLC相⽐，超⾼效液相⾊谱 检测法⼤⼤的节省试剂的使⽤，从⽽节约了成本[4] 。 超⾼效液相⾊谱法在植物Cys、GSH和PCs的检测⽅⾯应⽤越来越多，但对于实验条 件的具体优化普遍处于摸索阶段。在样品提取阶段和衍⽣化阶段实验⽅法的优化对于 测量的准确性有⾄关重要的影响。加标回收试验是实验室质量控制的⼀个重要⼿段， 是⼀种很好的优化实验条件的验证⼿段，加标回收试验原理简单，操作较为简便，有 很⾼的应⽤价值，加标回收试验在我校还没有开始⼤⾯积应⽤，本试验运⽤加标回收 试验原理寻找、检验最优实验条件。由于加标回收率能够很好的反应某种试验⽅法得 出的测量结果的准确度，所以将其运⽤到植物络合素的液相⾊谱检验中对试验分析的 准确度有良好的监控作⽤，所以也是⼀种⾼效简便的寻找最优实验条件的⽅法。加标 回收试验还能够及时发现误差来源[5] ，分析可发现是系统误差还是偶然误差，这对于 提出相应优化⽅法和提⾼检测⼈员的技术⽔平都有很⼤帮助。 1 材料与方法 1.1 标准液的配制 分别称取适量各巯基化合物标准品,⽤ 0.1% TFA 溶液(含 6.3 mmol/ L DTPA)配制成质 量浓度均为 100 mg / L 的单标准储备液，置于 4 °C 下保存。 使⽤时，根据需要逐级稀 释成不同质量浓度的混合标准⼯作液。 1.2 苗期⼩⻨的培养与处理 选取⼤⼩⼀致的⼩麦种⼦，⽤10% H2O2（w/w）表⾯消毒15分钟，冲洗⼲净后⽤去离 ⼦⽔浸泡12h。然后将⼩麦播于⽯英砂中萌发，3天后选取⽣长⼀致的⼩麦幼苗移⼊ 1.1L的盆钵中⽤1/4 Hoagland营养液培养。培养三天后，⽤10 µmol／L的As处理三天后 (责任编辑：qin) |